基于体外、体内化学物质基础对肾气丸“阴中求阳”配伍机制的研究

摘要

目的：研究肾气丸“阴中求阳”的配伍规律和组方原理，通过建立稳定、可靠的的高效液相色谱检测条件，对肾气丸有效成分桂皮醛、丹皮酚、马钱苷的测定，根据其变化情况，分析其“阴中求阳”的组方配伍机理。并通过分析肾气丸各拆方组配伍体外化学成分谱及体内入血成分谱，进一步阐释其配伍机理，并为后续体内有效成分谱药动学研究打下基础。
　　方法：通过对肾气丸各拆方组不同流动相、检测波长等方法学的考察，探索 HPLC色谱条件，建立检测肾气丸各主要有效成分的HPLC方法。根据肾气丸“阴中求阳”的配伍特点，结合肾气丸组方药物的“三补”、“三泻”将肾气丸进行拆方分组。根据建立的色谱条件，测定肾气丸各拆方组体外、血清中有效成分桂皮醛、丹皮酚、马钱苷，比较峰面积情况，分析各配伍对这3种有效成分的影响；并在同一色谱条件下，检测各味药、拆方肾气丸组以及各组分别给药后所得血清样品，比较其色谱变化情况，分析鉴定给药后后大鼠血清中移行成分、生药来源及其代谢产物，初步阐释肾气丸“阴中求阳”配伍机理。
　　结果：所建立色谱条件：色谱柱Platisil(铂金) ODS（5μm，250×4.6mm）；流动相：乙腈-1%冰乙梯度洗脱，流速0.5ml/min，检测波长254nm；柱温25℃，进样量5μl。其对肾气丸各拆方组的检测稳定性、精密度、重复性良好。通过对各肾气丸拆方配伍组进行检测结果显示：全方共检测得61个峰，其中的峰8，22，26，29，32-33，35，37-38，48，50，52-53，55，58，60等16个峰来自丹皮；峰15，19-21，23，25，28，31，40，43等共有10个峰来自山茱萸；峰14，34来自干地黄；峰28，32，38，54等共4个峰来自桂枝；茯苓、山药、泽泻及附子未见有峰流出；峰13，17-18，24，27，30，36，39，42，44-47是丹皮和山茱萸的共流出峰；峰11，49是丹皮和干地黄的共流出峰；峰41，51是丹皮、干地黄和桂枝的共流出峰。各拆方肾气丸组桂皮醛的情况：“阴中求阳”的肾气丸全方组提取液中桂皮醛峰面积明显高于双补组、补阳组及桂枝单味药组。补阳血清组、双补血清组桂皮醛的峰面积逐渐减少，而肾气丸血清组中桂皮醛呈现增加的趋势。各拆方肾气丸组马钱苷的情况：体外双补组的马钱苷峰面积最大，“阴中求阳”肾气丸全方组次之。而在体内各血清配伍组中马钱苷峰面积均有减少的趋势，其中以“阴中求阳”肾气丸血清组最为明显。各拆方肾气丸组丹皮酚的情况：“阴中求阳”的肾气丸血清组丹皮酚的峰面积有明显的增加。通过对肾气丸提取液给药后的大鼠血清色谱图的分析，初步对肾气丸的血中移行成分进行来源归属。在干地黄色谱图分析中，初步确定20、21、23号峰为干地黄直接入血成分，28、37、38、39号峰为入血后代谢成分。在山药色谱图分析中，推测21、29、31号峰为山药入血代谢成分，其中21号峰在干地黄中也有贡献，故推测干地黄与山药中所含的物质被代谢后共同产生该成峰。在茯苓色谱图分析中，推测20、21、26、29号峰为茯苓入血代谢成分，其中26、29号峰为体外肾气丸直接入血成分，而在体外茯苓均没发现这四个成分，所以推测茯苓吸收代谢后转化为活性成分或配伍产生有效成分后入血。其中干地黄、山药、茯苓对20号峰均有贡献，表明复方配伍的必要性及科学性。在泽泻色谱图分析中，未能检测出有效成分。
　　结论：肾气丸“阴中求阳”的配伍规律，主要是通过方中大量的补阴药物配以小剂量桂枝、附子来体现。通过对其配伍有效成分的考察结果显示：桂枝、附子配伍干地黄、山茱萸、山药后有利于桂枝主要成分桂皮醛的溶出，且配伍“三泻”后有进一步促进桂皮醛溶出的趋势，正体现了复方肾气丸中桂枝“少火生气”的配伍原则。补阳血清组、双补血清组中桂皮醛的峰面积逐渐减少，考虑配伍“三补”后，可能产生或转化成其他代谢成分，而在肾气丸血清组中桂皮醛却又呈现增加的趋势，表明在配伍“三泻”后能增强其入血的转移能力，也体现了“三泻”在方中的必要性和科学性。以“阴中求阳”的肾气丸全方组中马钱苷的峰面积较双补组的减小，推测干地黄、山药、山茱萸配伍后一方面有促进有效成分溶出的作用，从而增强其滋阴补肾的作用，另一方面在配伍“三泻”后，却降低或影响某些有效成分的溶出，体现了“补中有泻，合中有开”组方原则，这也是肾气丸配伍的目的所在；而在体内各配伍组中马钱苷峰面积均有减少的趋势，其中以肾气丸全方组最为明显，推测一方面由于桂枝与山茱萸配伍后入血代谢后生成其它成分的可能性，一方面推测配伍“三泻”后有影响山茱萸入血的情况。“阴中求阳”的肾气丸全方组入血后丹皮酚的峰面积有明显的增加，提示方中干地黄、山茱萸、山药有助于丹皮酚的溶出，并能增强其入血的转移能力。初步推测丹皮酚是“阴中求阳”肾气丸入血后发挥药效的主要成分之一。复方肾气丸入血成分是其发挥临床作用的物质基础，本研究对肾气丸血中移行成分及代谢产物来源归属的考察，为将来深入血清有效成分研究奠定了基础，有助于阐明复方肾气丸的有效成分及作用机理。

目录

声明

引言

第一部分 文献研究

1 肾气丸的研究概況

1.1 肾气丸的实验药理研究

1.2 临床运用研究

1.3 肾气丸药理、化学成分研究

2 高效液相色谱(HPLC)的研究概况

3 中药血清化学研究

3.1 中药血清药化学”的提出

3.2 中药血清药物化学的研究现状

4 本项研究的意义

5 肾气丸全方HPLC分析方法及血清药物化学的研究思路

第二部分 实验研究

第一章 拆方肾气丸HPLC方法学研究

第一节 肾气丸各拆方组供试液制备

第二节 拆方肾气丸HPLC分析方法的建立

第二章 拆方肾气丸配伍对有效成分影响的初步研究

第一节 拆方肾气丸配伍对桂皮醛体外、体内影响的初步研究

第二节 拆方肾气丸配伍对马钱苷体外、体内影响的初步研究

第三节 拆方肾气丸配伍对丹皮酚体外、体内影响的初步研究

第三章 拆方肾气丸化学成分体外、体内色谱图初探

1 实验材料

2 实验方法

3“阴中求阳”肾气丸化学成分的来源认定

结语

展望

参考文献

在学期间发表论文情况

致谢