特异核基质蛋白在人食管癌EC9706细胞凋亡中作用的初步研究

摘要

本论文以姜黄素(curcumin，Cur)处理人食管癌EC9706细胞，在鉴定姜黄素对人食管癌EC9706细胞凋亡诱导效果的基础上，综合应用亚细胞蛋白质组学分析、免疫细胞化学、细胞分子生物学等技术，对EC9706细胞凋亡过程中核基质蛋白的变化进行了较为系统的研究。分析鉴定和确证与EC9706细胞凋亡相关的特异核基质蛋白，并研究特异核基质蛋白与人食管癌EC9706细胞凋亡相关基因在细胞内的共定位关系与变化，探索它们在人食管癌细胞凋亡诱导过程中的调控作用，以期能够在较为整体水平上进一步认识人食管癌细胞癌变与凋亡机理问题，从而找出人食管癌细胞凋亡相关的靶向性蛋白和深入探索的研究方向。 实验结果表明，经30μmol/L姜黄素处理之后，EC9706细胞增殖受到明显抑制，细胞生长抑制率达83.88％，细胞发生G0/G1期阻滞。光镜观察结果显示，经姜黄素诱导处理后的EC9706细胞出现了细胞体积缩小、核质比例减小、细胞核固缩、核内染色质凝聚等显著的细胞凋亡特征。琼脂糖凝胶电泳显示EC9706细胞出现凋亡典型的DNA梯状条带。Hoechst染色显示细胞核内出现浓染致密的固缩形态或颗粒状荧光。免疫细胞化学检测结果显示，经姜黄素处理后，EC9706细胞内的抑凋亡基因bcl-2表达下调，促凋亡基因bax、p53、fas等表达上调。双向凝胶电泳与质谱分析共鉴定12种蛋白，其中在凋亡的EC9706细胞中表达上调的有：Transcription elongation factor A(SII)-like4(TCEAL4)、CCT8protein、Tara等3种核基质蛋白；表达下调的有：Prohibitin、Spindling-2B、Nucleophosmin、Translation initiation factor eIF-2B subunit beta等9种核基质蛋白。并进一步通过蛋白免疫印迹确证了Nucleophosmin、Prollibin、HSP70、Spindling-2B、Vimentin等核基质蛋白的变化。激光共聚焦显微镜观察显示特异核基质蛋白Nucleophosmin、Prohibitin、HSP70、Spindling-2B等与抑凋亡基因bcl-2和促凋亡基因bax表达产物在细胞内均存在一定的共定位关系，并且它们的表达水平和细胞定位在细胞凋亡诱导前后均发生了改变。 研究结果表明，30μmol/L姜黄素对人食管癌EC9706细胞凋亡具有显著诱导作用，并上调促凋亡基因bax、p53、fas的表达和下调抑凋亡基因bcl-2的表达。在EC9706细胞凋亡过程中，其核基质蛋白组成产生了TCEAL4、CCT8 protein、Tara等3种蛋白表达上调和Prohibitin、Spindling-2B、Nucleophosmin等9种蛋白表达下调的明显变化。其中，差异表达核基质蛋白Nucleophosmin、Prohibitin、HSP70、Spindling2B与EC9706细胞中Bcl-2和Bax蛋白均存在共定位关系，并在细胞凋亡过程中出现移位和分布的改变。由此证实了与人食管癌细胞凋亡相关的特异核基质蛋白的存在和特异核基质蛋自在肿瘤细胞凋亡中的重要作用。研究结果表明姜黄素对人食管癌EC9706细胞凋亡的诱导与其改变食管癌细胞核基质蛋白的表达，从而调控细胞凋亡相关基因活性，诱导细胞凋亡具有重要的关系。这为在较为整体的水平上深入研究肿瘤细胞凋亡诱导的调控机制以及阐明细胞癌变与凋亡机理提供了科学依据和深入探索研究的新方向，并为食管癌的防治和进一步研究提供新的靶向性蛋白。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

1肿瘤细胞凋亡诱导及其调控机理研究意义与问题

2细胞核基质及其在细胞生命活动中的重要作用

2.1核基质

2.2核基质蛋白和核基质结合蛋白

2.3核基质异常和细胞癌变关系的研究

2.4核基质在细胞凋亡中的变化研究

3食管癌细胞凋亡研究及其存在问题

4姜黄素及其在细胞凋亡研究中的应用

5本论文具体研究工作及其科学意义

材料与方法

1 试剂与材料

2主要仪器

3细胞培养与凋亡诱导处理

3.1细胞培养

3.2凋亡诱导物与细胞凋亡诱导处理

4姜黄素对人食管癌EC9706细胞凋亡的诱导作用

4.1生长曲线的测定

4.2细胞周期的测定

4.3 HE染色细胞形态光镜样品制备

4.4 Hoechst染色

4.5 DNA提取与电泳分析

4.6人食管癌EC9706细胞凋亡相关基因表达产物的免疫细胞化学检测

5姜黄素诱导人食管癌EC9706细胞凋亡过程中核基质蛋白的组成变化

5.1核基质蛋白的抽提

5.2双向凝胶电泳分析

5.3 MALDI-TOF质谱分析

5.4蛋白质印迹杂交检测

6激光共聚焦显微镜观察样品的制备与观察

实验结果

1姜黄素对人食管癌EC9706细胞凋亡的诱导效果

1.1姜黄素诱导处理前后EC9706细胞生长曲线的测定结果

1.2姜黄素诱导处理前后EC9706细胞周期的测定结果

1.3姜黄素诱导处理前后EC9706细胞H.E.染色结果

1.4姜黄素诱导处理前后EC9706细胞140chest染色结果

1.5姜黄素诱导处理前后EC9706细胞DNA电泳结果

1.6姜黄素对人食管癌EC9706细胞凋亡相关基因表达的影响

小结

2姜黄素诱导人食管癌EC9706细胞凋亡过程中核基质蛋白表达的变化

2.1双向电泳与凝胶图像分析结果

2.2差异表达的核基质蛋白的MALDI-TOF质谱和肽指纹鉴定结果

2.3差异表达的核基质蛋白的确证

3特异核基质蛋白在姜黄素诱导人食管癌EC9706细胞凋亡过程中的变化

3.1 PHB与抑凋亡基因bcl-2及促凋亡基因bax表达产物在细胞内的共定位观察结果

3.2 NPM与抑凋亡基因bcl-2及促凋亡基因bax表达产物在细胞内的共定位观察结果

3.3 HSP70与抑凋亡基因bcl-2及促凋亡基因bax表达产物在细胞内的共定位观察结果

3.4 Spindlin-2B与抑凋亡基因bcl-2及促凋亡基因bax表达产物在细胞内的共定位观察结果

讨论

1姜黄素对人食管癌EC9706细胞凋亡的诱导作用

1.1姜黄素对EC9706细胞的增殖与细胞周期进程的影响

1.2姜黄素对EC9706细胞形态的影响

1.3姜黄素对EC9706细胞核与DNA的影响

1.4姜黄素对EC9706细胞凋亡相关基因表达的影响

小结

2姜黄素对人食管癌EC9706细胞凋亡过程中核基质组成变化的影响

2.1姜黄素对EC9706细胞凋亡过程中核基质组成变化的影响

2.2差异表达核基质蛋白的确证

3差异核基质蛋白在EC9706细胞凋亡过程中的功能作用

3.1 LMNA

3.2 Vimentin

3.3 Prohibitin

3.4 Nucleophosmin

3.5 HSP70

3.6其它蛋白

小结

4特异核基质蛋白在人食管癌EC9706细胞凋亡过程中与凋亡相关基因产物Bcl-2和Bax的关系

4.1 Bcl-2与特异核基质蛋白的关系

4.2 Bax与特异核基质蛋白的关系

小结

5特异核基质蛋白在姜黄素诱导EC9706细胞凋亡过程中的调控作用

结论

参考文献

版图说明

致谢