姜黄素诱导食管癌EC9706细胞凋亡过程中核基质蛋白的表达变化

摘要

本文在鉴定姜黄素(curcumin，Cur)诱导人食管癌EC9706细胞凋亡的基础上，应用选择性抽提整装透射电镜和蛋白质组学分析技术，对EC9706细胞凋亡诱导过程中核基质-中间纤维系统的构型变化和核基质蛋白组成变化进行系统研究。分析鉴定与食管癌细胞凋亡相关的特异核基质蛋白，并探索它们在食管癌细胞凋亡过程中的调控作用，以期能够从较为整体的水平上进一步认识食管癌细胞凋亡及其机理，从而找出食管癌细胞凋亡研究的新方向。 实验结果显示，经8μg/mL，姜黄素处理之后，EC9706细胞增殖受到明显抑制，细胞生长抑制率达69.9％；细胞周期检测出现亚二倍体(亚G1期)细胞峰值，细胞凋亡率达23.0％，并发生G2/M期阻滞；光镜和透射电镜观察结果显示，经姜黄素诱导处理后的EC9706细胞出现了细胞体积缩小、核质比例减小、细胞核固缩、核内染色质凝聚、线粒体肿胀、内质网网腔扩大、形成凋亡小体等显著的细胞凋亡特征；而且与凋亡相关的原癌基因bcl-2表达下调，促凋亡基因p53、fas、bax等表达上调。选择性抽提整装光镜和电镜观察显示，经姜黄素处理的EC9706细胞，其核基质-中间纤维系统虽然还能保持较为完整的网状结构，但纤维的数量和密度明显比对照组稀疏，且分布更加不均匀，并有局部的纤维断裂存在，核基质-中间纤维系统整体构型趋向于崩解；双向凝胶电泳分析显示在姜黄素诱导EC9706细胞凋亡前后存在31个差异表达的核基质蛋白，经质谱分析，鉴定了其中的12个蛋白，其中在凋亡的EC9706细胞中表达上调或新出现的蛋白有8个：Ran-binding protein3-like、Mitochondrial28S ribosomal protein S30、Rho guanine nucleotide exchange factor19、Rap1 GTPase-activating protein2、Hsp70-binding protein1、2-5A-dependent ribonuclease、Adseverin、TATA element modulatory factor；表达下调的蛋白质有4个：Probable peptidyl-tRNA hydrolase、ATP synthase mitochondrial F1 complex assembly factor1、Serine protease hepsin、Cell division protein kinase6。其中除Adseverin外，其它蛋白质均首次在核基质中发现。 研究结果表明，8μg/mL姜黄素对人食管癌EC9706细胞的凋亡具有显著诱导作用，在EC9706细胞凋亡过程中，不仅其核基质-中间纤维系统构型产生了明显的凋亡特征性变化，而且其核基质蛋白组成也相应发生了明显改变。由此证实了与食管癌细胞凋亡相关的特异核基质蛋白的存在及其对食管癌细胞凋亡诱导的调控作用。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

1 细胞凋亡及其调控机理的研究

1.1 细胞凋亡的作用及其与肿瘤发生的关系

1.2 细胞凋亡调控机理的研究及存在的问题

2细胞核基质及其在细胞癌变和凋亡中的变化研究

2.1 细胞核基质的重要作用

2.2 核基质与细胞癌变的关系

2.3 细胞核基质在细胞凋亡中的变化研究

3姜黄素及其在肿瘤细胞凋亡研究中的应用

3.1 姜黄素的抗肿瘤作用

3.2 姜黄素诱导细胞凋亡的作用

4食管癌细胞及其凋亡研究进展

4.1 食管癌细胞的生物学特性

4.2 食管癌发生的分子生物学机制

4.3 食管癌细胞凋亡研究及其存在的问题

5本论文研究拟解决的具体科学问题及其意义

实验方法

1细胞培养和诱导处理

1.1 细胞培养

1.2 凋亡诱导物与细胞的凋亡诱导处理

2姜黄素对食管癌EC9706细胞生长的影响

2.1 生长曲线的测定

2.2 细胞周期的变化

3姜黄素对EC9706细胞的凋亡作用

3.1 HE染色细胞形态光镜样品制备

3.2 Hochest染色

3.3 全细胞扫描电镜观察

3.4 透射电镜样品制备与观察

4姜黄素对EC9706细胞凋亡相关基因表达的影响

4.1 抑凋亡基因Bcl-2

4.2 促凋亡基因p53、bax、fas

5姜黄素处理EC9706细胞前后细胞变化核基质-中间纤维构型的变化

5.1 核基质-中间纤维(NM-IF)的选择性抽提

5.2 核基质-中间纤维整装抽提技术光镜观察

5.3 核基质-中间纤维整装抽提技术电镜观察

6姜黄素诱导EC9706细胞凋亡过程中核基质蛋白的表达变化

6.1 核基质蛋白抽提

6.2 聚丙烯酰胺双向电泳

6.3 MALDE-TOF-MS质谱分析

实验结果

1 姜黄素处理前后EC9706细胞生长曲线、细胞周期的变化

1.1 姜黄素对EC9706细胞增殖的影响

1.2 姜黄素对EC9706细胞周期的影响

2姜黄素处理EC9706细胞后细胞形态及超微结构的变化

2.1 H.E.染色

2.2 Hochest染色

2.3 全细胞扫描电镜图

2.4 透射电镜观察

3姜黄素对凋亡相关癌基因、抑癌基因表达的影响

3.1 姜黄素对EC9706细胞抑凋亡基因bcl-2的影响

3.2 姜黄素对EC9706细胞促凋亡基因bax的影响

3.3 姜黄素对EC9706细胞促凋亡基因p53的影响

3.4 姜黄素对EC9706细胞促凋亡基因fas的影响

4姜黄素诱导EC9706细胞凋亡过程中核基质构型的变化

4.1 核基质-中间纤维整装抽提光镜观察结果

4.2 核基质-中间纤维系统整装抽提电镜观察结果

5姜黄素诱导EC9706细胞前后核基质蛋白的表达变化

5.1 双向电泳结果

5.2 差异表达核基质蛋白的MALDI-TOF质谱和肽指纹鉴定结果

讨论

1姜黄素对人食管癌EC9706细胞凋亡的诱导作用

1.1 姜黄素对EC9706细胞生长增殖的抑制及对细胞周期的影响

1.2 姜黄素诱导EC9706细胞凋亡过程中细胞形态及超微结构的变化

1.3 姜黄素对凋亡相关癌基因、抑癌基因表达的影响

小结

2姜黄素诱导EC9706细胞凋亡过程中核基质-中间纤维构型的变化

3人食管癌EC9706细胞凋亡过程中核基质蛋白组成的变化

3.1 核基质蛋白在EC9706细胞凋亡中的表达变化

3.2 差异核基质蛋白在人食管癌EC9706细胞凋亡中的功能和作用

小结

4特异核基质蛋白在食管癌EC9706细胞凋亡诱导过程中的调控作用

结论

参考文献

版图说明

致谢