龙眼品种的ISSR分析及焦核性状的分子标记研究

摘要

龙眼是我国南方亚热带特产名贵水果，我国科学工作者已就龙眼分类和鉴别做了一些工作，但已有的研究仍然存在部分品种分类结果不一致的现象，不利于龙眼生产发展；并且近年来福建省新选育(发现)了一些新的株系，其亲缘关系有待研究和证实；此外，在福建省陆续发现了一些龙眼焦核单株，这些单株的亲缘关系未见有较为全面的研究报道。本研究建立龙眼ISSR技术体系，运用ISSR技术进行龙眼遗传多样性的分子评价和分类研究，分析一些新选育单株(株系)和焦核单株的亲缘关系；同时，寻找与龙眼焦核性状相关的ISSR分子标记，为焦核龙眼的选育种提供依据。主要研究结果如下： 1、龙眼叶片DNA提取方法的改进：龙眼叶片中富含色素、单宁和多糖，采用改良CrAB法从龙眼叶片提取较高质量的DNA。龙眼叶片研磨后，加入丙酮抽提这一步骤，可有效去除色素和单宁，对于老叶，可进行2-3次反复抽提；在DNA中加入1/10体积乙醇，1/30体积Na．Ac,冰浴1小时，再加入等体积氯仿混匀，1000g离心10min,吸取上清，重新沉淀DNA可去除龙眼中富含的多糖。 2、龙眼ISSR-PCR反应体系的优化：建立适合龙眼的ISSR技术体系。龙眼ISSR-PCR反应最佳体系是：20μL体积中，模板DNA 25 ng，引物0.2μmol/L，dNTPs 100 μmol/L，Taq DNA聚合酶1.0 U，MgCl<,2> 2.5 m mol/L，10×PCR缓冲液2,5μL。ISSR-PCR扩增反应的优化程序是：94℃预变性5 min；94℃变性1min，52℃退火1 min，72℃延伸90s，41个循环；72℃延伸7 min，退出。 3、龙眼遗传资源的ISSR分析：筛选来自Llniversity of British Columbia．Biotechnology Lab(UBCBL)的100个引物，获得12条多态性明显的引物；以这12条引物分析龙眼51份样品，共产生155条扩增带，平均每个引物产生的条带为12.9，不同引物获得的扩增带从10条～16条不等，其中最多的uBC873，为16条，最少的是UBC840产生10条酶带，DNA扩增酶带的多态性为95.4％，说明51份材料具有遗传多样性。根据ED法计算各样品间的遗传相似系数，采用UPGMA法进行龙眼亲缘关系分析，建立亲缘关系聚类树状图。以结合距离D=0.55为界，本研究可以将51份龙眼遗传资源分为中国龙眼和泰国龙眼两大类型，以D=0.27为界时，把供试的46份中国龙眼遗传资源分为8组。 4、焦核性状ISSR分子标记研究：采用集团分离分析(Bulkedsegregantanalysis,BSA)方法，等量混合焦核单株的DNA构建焦核池Pc，等量混合非焦核单株的DNA,构建非焦核池Ps，ISSR扩增两个池间的差异片段。从12多态性高的引物中筛选到引物UBC842在焦核池中扩增出特异的约666bp DNA条带，在8个焦核单株和8个非焦核品种间的扩增进一步证实666bpDNA条带只存在于焦核单株中，而在非焦核品种中没有该片段，从而初步认为引物UBC842扩增出的666bp DNA条带与龙眼焦核性状相连锁。

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摘要

第一章引言

第二章龙眼品种的ISSR分析

1.材料和方法

1.1供试材料

1.2主要实验仪器、试剂及试验所需溶液的配置

1.3龙眼基因组DNA的提取

1.4龙眼基因组DNA的ISSR-PCR扩增反应

1.5检测与成像

1.6数据分析

2.结果与分析

2.1龙眼基因组DNA的提取结果与分析

2.2 ISSR-PCR扩增反应体系的优化

2.3 51份供试材料的ISSR扩增分析

3.讨论

3.1龙眼DNA的提取

3.2 ISSR-PCR扩增反应体系及程序的建立

3.3 ISSR-PCR扩增对基因组DNA的要求

3.4关于龙眼的ISSR分析

3.5龙眼遗传多样性分析

第三章龙眼焦核性状的ISSR分子标记研究

1.材料与方法

1.1焦核池和非焦核池的建立

1.2焦核池和非焦核池多态性引物的筛选

1.3个体检测验证

1.4特异条带的回收及检测

1.5目的片段与pMD18-T-vector的连接

1.6大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备——CaCl2法

1.7连接产物的转化与蓝白斑筛选

1.8重组质粒的PCR检测

2.结果与分析

2.1焦核池和非焦核池的多态性

2.2分离集团中各单株ISSR分析

2.3特异条带的测序

3.讨论

3.1关于所选ISSR标记UBC842666

3.2 ISSR标记转换的必要性及方法

参考文献

致谢