骨髓干细胞在睾丸中横向分化可能性的探索

摘要

睾丸是雄性个体最重要的生殖器官，它不仅是精子生成的重要场所，而且还具有分泌雄性激素、维持副性特征的功能。睾丸中主要有三种细胞——赖氏细胞、支持细胞、生殖细胞。赖氏细胞位于曲细精管之间，其分泌的睾酮等雄性激素维持着睾丸内外的激素环境；支持细胞位于睾丸曲细精管内基底膜附近，它们之间的紧密连接形成血睾屏障，将分化至各阶段的生殖细胞包裹在其中，为精子发生提供免疫豁免环境。最近的研究证实在睾丸中支持细胞为精原干细胞提供了一种通用的存活及分化环境，它不仅可以识别相同物种的精原干细胞，而且能识别不同物种的精原干细胞，并允许其回到曲细精管基底膜位置，重新启动增殖、分化过程。然而，在精子发生过程中，究竟支持细胞提供的微环境起主导作用还是生殖细胞本身的分化特性起主导作用尚不清楚。 另外，近年来干细胞方面的研究主要集中于胚胎干细胞和成体干细胞。尽管胚胎干细胞因有“发育全能性”而极具应用潜力，但因涉及到伦理问题而备受争议。而成体干细胞中的骨髓干细胞不存在伦理学方面的问题，获取方便，同时现有研究发现骨髓干细胞具有可塑性，能横向分化成多种组织器官细胞，如骨、软骨、脂肪、肌肉、肝脏、肾、心脏，甚至脑的细胞。由此，我们提出问题：在睾丸中，外源骨髓干细胞能否与支持细胞相互识别并横向分化为生殖细胞启动精子发生过程?如果答案是肯定的说明在干细胞分化发育中微环境起着关键的作用，相反，说明生殖细胞本身更重要。 鉴于以上认识，本实验从提取小鼠骨髓干细胞入手，分别采用睾丸网注射技术和尾静脉注射技术将具有遗传标记的供体骨髓干细胞移植到去除了内源性精原干细胞的野生型小鼠睾丸中，睾丸曲细精管为精子发生提供了一个特殊的微环境，同时也以供体精原干细胞对照进行相同的移植，观察骨髓干细胞在睾丸这个免疫豁免的特殊环境中是否能够增殖及分化。 结果显示，对照组移植80天后，受体小鼠曲细精管内供体精原干细胞大量增殖并重新启动生精过程，生成了精子，且交配试验获得了正常的仔鼠。对照组移植的结果说明本实验所使用的睾丸网细胞移植技术是成熟的。由于供体细胞在移植时是由睾丸网到达曲细精管管腔中，而精子发生却要首先从基底膜开始穿越支持细胞间形成的紧密连接再到达管腔，证明异体外源精原干细胞可以逆向穿越受体小鼠睾丸的血睾屏障，回到基底膜位置重新定位(归巢)，并可以在支持细胞的营养调节下启动增殖、分化，最终形成精子；亦证明了精原干细胞的移植确实能够使受体小鼠恢复生育能力，为本研究提供了技术保障。 实验组分两种情况，一是将供体骨髓干细胞经睾丸网移植到受体小鼠睾丸中，二是将供体骨髓干细胞经尾静脉移植到受体小鼠的血液中。睾丸网移植结果显示，移植后的受体小鼠睾丸恢复了生精过程，同时原位PCR技术进一步证明此睾丸中的生殖细胞来源于供体骨髓干细胞，说明外源骨髓干细胞在受体小鼠曲细精管中可以归巢和增殖，即可以分化成为生殖细胞；经尾静脉注射的骨髓干细胞在受体小鼠睾丸中的分化结果显示，移植后6M，常规检测得知野生型受体小鼠曲细精管上皮仍然很薄(只有一层睾丸支持细胞)，在睾丸中未见任何供体来源的细胞，也没有生殖细胞归巢或增殖的迹象，说明供体骨髓干细胞不能够经过血液循环到达睾丸管腔中。由上可知，将外源骨髓干细胞经睾丸网移植到去除了内源性精原干细胞受体小鼠睾丸后，它们可以逆向通过睾丸的血睾屏障到达曲细精管基底膜(归巢)，横向分化成为生殖细胞启动精子发生过程，即支持细胞可以识别外源的骨髓干细胞，允许其归巢，重新启动增殖、分化过程。但经尾静脉注射的骨髓干细胞则无法到达睾丸的曲细精管内。 本课题采用睾丸网注射技术和尾静脉注射技术研究外源骨髓干细胞与睾丸内微环境的相互关系及其横向分化潜能，结果发现通过血液移植骨髓干细胞无法使其在受体睾丸中归巢并增殖、分化，而通过睾丸网移植骨髓干细胞能够使其在受体睾丸中归巢并增殖、分化，说明在骨髓成体干细胞的分化过程中其微环境具有关键的作用，它可以诱导干细胞改变分化方向或进程即横向分化。。本研究不仅为最终阐明睾丸内细胞间的相互作用提供可靠的依据；而且对探讨骨髓干细胞的横向分化潜能具有重要的理论意义，同时为后续成体干细胞横向分化技术的研究打下基础，也为推动成体干细胞的临床应用起到积极的作用，可为男性不育患者带来福音。

目录

文摘

英文文摘

首都师范大学位论文原创性声明及授权使用声明

第一部分文献综述及本题意义

一、干细胞研究进展

1.干细胞的定义及特征

2.干细胞的分类

3.胚胎干细胞

4、成体干细胞

二、精原干细胞移植技术研究进展

1、精原干细胞

2、精原干细胞移植技术的发展历程

3、移植方法

4、精原干细胞移植的研究和应用前景

5、精原干细胞移植潜在的问题

三、本题的研究内容和意义

四.实验设计的创新点

第二部分实验材料和方法

一、实验材料

1、实验动物

2、实验试剂

二、实验方法与步骤

1、HSL小鼠基因型的鉴定

2、对照组精原干细胞及实验组骨髓干细胞的移植

3.组织学检测

4.原位PCR检测供体骨髓干细胞的增殖情况

第三部分结果和分析

一、HSL小鼠基因型的鉴定

1、全基因组DNA提取结果与分析

2、PCR扩增HSL/LacZ基因的结果与分析

二、对照组精原干细胞移植

1、小鼠睾丸外观体积比较

2.小鼠睾丸指数比较

3.小鼠睾丸石蜡切片观察结果及分析

4.小鼠交配产子情况

三、运用睾丸网注射方法将HSL+/小鼠骨髓干细胞移植到野生型小鼠

1.小鼠睾丸外观体积比较

2.小鼠睾丸指数比较

3.小鼠睾丸石蜡切片显微镜观察结果及分析

4.小鼠睾丸原位PCR结果及分析

5.小鼠交配产子情况

四、运用尾静脉注射方法将HSL+/小鼠骨髓干细胞移植到野生型小鼠

1.小鼠睾丸外观体积比较

2.小鼠睾丸指数比较

3.小鼠睾丸石蜡切片观察结果及分析

第四部分讨论和结论

一、关于受体及供体动物的讨论

1、关于受体动物模型建立的讨论

2、关于供体骨髓干细胞的选择和提取

二、关于对照组精原干细胞移植的讨论

三、采用睾丸网注射技术移植的骨髓干细胞在受体小鼠睾丸中的分化结果讨论

四、经尾静脉注射的小鼠骨髓干细胞在受体小鼠睾丸中分化结果的讨论

五、骨髓干细胞移植到受体后横向分化的成功率

第五部分结论和展望

一、结论

二、展望

参考文献

附录

附录一 缩写词一览表

附录二 溶液配制

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文