p58促进2型糖尿病发展及其机制的研究及GLP-1受体的克隆与表达

摘要

2型糖尿病的发生是一个十分复杂的过程，受环境和遗传等多种因素的影响。近期的研究结果显示CDC2L2是中国北方汉族人2型糖尿病的易感基因，p58为此基因的一个编码蛋白。我们前期细胞水平的研究结果显示p58可通过诱导β细胞的凋亡促进2型糖尿病的发生发展，本研究中我们以建立的2型糖尿病大鼠模型为研究对象，在整体水平上对不同阶段的2型糖尿病大鼠胰腺组织中p58及凋亡相关蛋白的表达水平进行检测，从而阐述p58与β细胞凋亡及2型糖尿病发生发展之间的关系。 研究中，我们利用RT-PCR和WesternBlot方法对不同发病阶段大鼠胰腺组织中p58的mRNA水平和蛋白水平进行检测；利用WesternBlot方法对大鼠胰腺组织中Bcl—2凋亡家族的抑凋亡因子Bcl—2、促凋亡因子Bax及细胞凋亡标志蛋白聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶(PARP)的剪切体(CleavedPARP，89kD)进行检测。结果显示：在2型糖尿病的早、中、后期，即实验的第17、25和50天(STZ注射第4、12、37日)，2型糖尿病大鼠胰腺组织中p58的mRNA和蛋白水平均明显升高(P<0.05)；在2型糖尿病发展后期，即实验第50日，大鼠胰腺组织中Bcl—2表达水平下降(P<0.05)，Bax表达水平升高(P<0.05)，同时我们还检测到了CleavedPARP。 凋亡相关因子Bcl—2、Bax及CleavedPARP的检测结果显示大鼠胰腺组织在2型糖尿病的后期发生细胞凋亡；p58的表达上调早于凋亡的发生，提示p58可能诱导β细胞凋亡的发生。 以上研究结果初步揭示了2型糖尿病早期的高糖环境可诱导胰岛β细胞p58表达上调，而上调的p58通过改变凋亡相关因子的表达促进β细胞凋亡，并最终促进了2型糖尿病病程的发展。此外，本结果在动物水平上进一步验证了本实验室之前的细胞实验的结果。 胰高血糖素样肽—1(GLP—1)是由小肠L细胞(Langerhanscell)分泌的生物活性肽，由于其在改善2型糖尿病相关症状中作用显著，近年来已成为2型糖尿病药物研发的新靶点。GLP—1生物活性的发挥主要通过其受体(GLP—1R)传导启始，因此对GLP—1R的研究同样具有重要的意义。本研究中我们通过克隆和表达胰高血糖素样肽—1受体(GLP—1R)为进一步构建GLP—1R的真核细胞系及筛选GLP—1类似物提供了实验基础。 首先，在培养的INS—1细胞中提取细胞总RNA，经RT-PCR技术扩增出GLP—1受体的编码序列。然后将经过鉴定的GLP—1RcDNA连接到原核表达载体pGEX—4T—1和真核表达载体pCMV-Tag2B中，并进行测序鉴定。最后，将获得的pGEX—4T—1—GLP—1R转化大肠埃希菌感受态细胞BL21(D3)，经异丙基硫代-β—D-半乳糖苷(IPTG)诱导后收集菌体蛋白，并通过SDS-PAGE对收获的融合蛋白进行鉴定。 通过上述实验，我们成功的获取了GLP—1R的编码序列，构建了原核表达载体pGEX—4T—1—GLP—1R和真核表达载体pCMV-Tag2B—GLP—1R，并使GLP—1R在大肠埃希菌BL21(D3)中表达。表达的融合蛋白主要存在于上清液中，分子量大小约为83kD。本实验结果为获取GLP—1R大量蛋白样品制备抗体提供了可能；同时，GLP—1R真核表达载体的构建也为建立2型糖尿病的新药筛选平台提供了条件。

目录

论文说明：缩略词表

声明

第一部分STZ诱导的2型糖尿病大鼠胰腺组织中p58的表达及其与β细胞凋亡关系的研究

前言

材料与方法

1实验材料

2实验方法

实验结果

1.胰腺组织p58检测结果

2胰腺组织凋亡相关因子表达水平的检测

讨论

参考文献

第二部分 大鼠胰高血糖素样肽-1受体的克隆和表达

前言

材料与方法

1实验材料

2.实验方法

实验结果

1 GLP-1R cDNA的克隆及扩增产物的初步鉴定

2原核表达载体pGEX-4T-1-GLP-1R的构建和鉴定

3真核表达载体pCMV-Tag2B-GLP-1R的构建和鉴定

4 pGEX-4T-1-GLP-1R的测序鉴定

5 GLP-1R原核表达载体在大肠埃希菌中的诱导表达

6 Western Blot鉴定融合蛋白

讨论

参考文献

综述 GLP-1与2型糖尿病的治疗

总结

致谢