运动及针刺干预对骨骼肌内质网应激-自噬反应的影响机制研究

摘要

目的：以CRT、FAM134B和LC3的分子作用为切入点，观察大负荷运动后骨骼肌内质网应激-自噬反应的发生情况，并分析内质网功能的变化；观察针刺干预对运动大鼠骨骼肌内质网应激-自噬反应的影响，并分析针刺对内质网功能受损的改善作用；探讨骨骼肌细胞内质网应激-自噬反应的分子机制。
　　方法：以雄性 SD大鼠和离体大鼠骨骼肌细胞（L6细胞）为研究对象。研究一将大鼠分为安静对照组和运动组，运动组进行一次持续下坡跑。研究二将大鼠分为安静对照组、单纯运动组、单纯针刺组和运动针刺组，其中运动组和运动针刺组进行一次持续下坡跑，单纯针刺组和运动针刺组施以针刺干预。各组大鼠又按照运动后不同时间点分为0h、12h、24h、48h和72h组，在对应时相取比目鱼肌进行指标测试。使用荧光探针法测定内质网钙离子浓度（[Ca2+]ER）、ELISA法测定Ca2+-ATP酶（SERCA）和蛋白二硫键异构酶（PDI）含量；应用Western Blot法检测内质网应激蛋白 GRP78、CRT，内质网自噬受体蛋白FAM134B、自噬标志蛋白LC3的表达；采用免疫荧光双染结合激光共聚焦显微镜观测FAM134B与CRT、LC3与CRT的共定位情况；运用免疫胶体金技术对定位于内质网的应激蛋白CRT进行标记，电镜下观察标记CRT的内质网自噬体状态。研究三分为对照组、内质网应激诱导剂毒胡萝卜素（TG）处理组和内质网应激抑制剂4-苯基丁酸（4-PBA）处理组，同一时间收取细胞测试各相应指标，并运用免疫共沉淀方法，证实 L6细胞内质网应激蛋白 CRT与自噬受体蛋白FAM134B、FAM134B与自噬标志蛋白LC3的相互作用。
　　结果：（1）大负荷运动后大鼠骨骼肌[Ca2+]ER急剧下降，SERCA和 PDI功能障碍；内质网应激蛋白GRP78、CRT表达上调，峰值出现在运动后即刻；自噬受体蛋白FAM134B和自噬标志蛋白LC3在内质网中表达升高且与CRT共定位增加，峰值出现在运动后12小时；电镜下可见不同阶段的自噬体中聚集CRT的免疫标记，以运动后12小时最为明显。（2）针刺干预可使运动大鼠骨骼肌[Ca2+]ER、SERCA和PDI含量升高；GRP78和CRT蛋白表达相应下调；FAM134B和LC3的转位以及与CRT共定位减少。（3）施加内质网应激诱导剂TG处理后，大鼠骨骼肌细胞内质网钙稳态失衡、功能障碍，CRT表达上调；FAM134B和LC3转位至内质网且与 CRT共定位增加；免疫共沉淀结果显示 CRT与FAM134B、FAM134B与LC3之间相互作用加强。
　　结论：（1）大负荷运动可诱导骨骼肌内质网钙离子紊乱、功能受损，随即通过CRT、FAM134B和LC3启动内质网应激-自噬反应。（2）运动后针刺可下调CRT蛋白表达，抑制FAM134B和LC3转位，进而通过有效调节内质网应激-自噬反应来缓解骨骼肌内质网功能受损。（3）骨骼肌细胞内质网应激-自噬反应的可能机制为：内质网钙稳态失衡、功能障碍后，CRT蛋白表达上调，FAM134B选择性锚定 CRT并招募 LC3，三者相互作用协同调控骨骼肌细胞内质网应激-自噬反应。

目录

声明

中英文缩略词对照表

1 前言

1.1 选题依据

1.2 研究内容

1.3 研究假设

1.4 技术路线

2 文献综述

2.1 内质网应激

2.2 内质网自噬

2.3 内质网应激-自噬反应

3 研究一 运动对大鼠骨骼肌内质网应激-自噬反应的影响

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.3 研究结果

3.4 分析与讨论

3.5 小结

4 研究二 针刺干预后运动大鼠骨骼肌内质网应激-自噬反应的变化

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.3 研究结果

4.4 分析与讨论

4.5 小结

5 研究三 骨骼肌内质网应激-自噬反应的机制研究

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.3 研究结果

5.4 分析与讨论

5.5 小结

6 全文总结

6.1 研究结论

6.2 创新点

6.3 研究展望

致谢

参考文献

附录

个人简历 在读期间发表的学术论文与研究成果