益气温阳通络法预防糖尿病大鼠视网膜病变发生的作用及机制研究

摘要

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)最为常见和严重的微血管并发症之一，早期预防可降低糖尿病致死、致残率，减轻国家巨大的医疗负担。目前DR的发病机制尚不明确，表观遗传调控成为近年来的研究热点。持续高糖状态下引起的表观遗传修饰的变化，在DR的发病中起重要作用，早期对其修饰的相关靶点进行药物干预对于逆转DR的发病进程十分关键。“早期治络、全程通络”是课题组预防糖尿病血管并发症的原创性理论，基于此，在DR的预防中主要使用益气温阳通络法，临床已有多年临床积累，益气温阳通络方根据益气温阳、活血化瘀通络的原则组方而成。前期研究表明，本方可调节视网膜缺血缺氧状态，改善视网膜血管微循环，但具体作用机制尚不十分明确，值得进一步研究。
　　研究目的:(1)探讨在糖尿病大鼠视网膜病变发生前预防性给予益气温阳通络方，是否可以延缓糖尿病大鼠DR的发生，改善血管内皮功能。(2)探讨益气温阳通络方是否可以通过降低伊文思蓝渗漏量，上调紧密连接蛋白的表达，从而降低视网膜血管通透性，保护血——视网膜屏障。(3)探讨益气温阳通络方是否可以通过上调microRNA-200b，下调VEGF与PEDF比值，以及上调Ang-1、Tie-2等关键靶基因的表达，从而改善视网膜内皮功能障碍，预防DR发生。(4)探讨益气温阳通络方是否可以通过上调microRNA-146a，调控NF-κB和P38-MAPK通路，下调ICAM-1、TNF-α的表达，抑制炎症状态，预防DR发生。(5)探讨益气温阳通络方是否可以改善胰腺病理损害、增加胰岛素表达、减少胰高血糖素表达，改善IRS-1的表达，从而延缓DR发生和发展。
　　研究方法:(1)雄性SD大鼠160只，随机分为正常对照组(n=40)、糖尿病模型组(n=40)、中药组(n=40)、西药组(n=40)。各组DM模型大鼠通过一次性腹腔注射链脲佐菌素(2％的STZ，60mg/kg)建立DM模型。中药组、西药组于造模成功次日分别以等效剂量的益气温阳通络方（42ml/kg·d）、羟苯磺酸钙（104mg/kg·d）灌胃治疗，正常组、模型组大鼠灌胃正常蒸馏水，于0、4、8、12、16、20、24周分别检测各组大鼠体重及随机血糖，于病程12或24周处死大鼠，并取材用于相关实验。采用苏木精-伊红(HE)染色观察各组大鼠视网膜组织病理学改变;采用视网膜血管消化铺片和过碘酸希夫染色(PAS)染色观察各组大鼠视网膜毛细血管的病理学改变。另外，采用雄性SD大鼠和BN大鼠各6只，随机分为正常对照组(n=6)、DM模型组(n=6)，使用Micron-Ⅲ视网膜影像系统进行眼底观察和荧光造影检查，观察各组大鼠DR的病理表现。(2)采用伊文思蓝(EB)灌注观察DR大鼠视网膜血管渗漏情况;采用免疫组化染色法、Western blot、RT-PCR法分别检测各组大鼠ZO-1、Occludin和Claudin-5的表达。(3)采用TUNEL法检测各组大鼠视网膜内皮细胞凋亡情况;免疫组化染色法检测VEGF、PEDF、Tie-2、ICAM-1在视网膜的表达;Western blot检测VEGF、VEGFR、PEDF、Ang-1、Tie-2、TNF-α、ICAM-1、NF-κB、p38-MAPK蛋白的表达量;RT-PCR法检测VEGF、p38-MAPK、miR-200b、miR-146a基因的表达。(4)采用HE染色观察各组大鼠胰腺组织病理学改变;采用免疫组化染色法检测胰岛素、胰高血糖素在胰腺的表达;Western blot检测IRS-1蛋白在胰腺的表达。
　　研究结果:1.对一般状态、体重、血糖及视网膜病理的影响:(1)成模后4周开始，DM大鼠的体重与正常组相比明显减轻，差异有显著统计学意义(P＜0.05)。中药组和西药组大鼠体重与DM模型组相比明显增加，差异有显著统计学意义(P＜0.05)。与正常组相比，DM组大鼠各时间点随机血糖显著升高(P＜0.05);而DM模型组、中药组、西药组大鼠随机血糖无显著差异(P＞0.05)。DM大鼠发病12周后晶状体浑浊情况:双侧混浊率(96％)，无混浊率(4％);正常组大鼠晶状体无混浊现象。(2)DM3月视网膜HE染色:正常组大鼠视网膜各层结构清晰;DM模型组视网膜组织轻微水肿，各层细胞界限模糊，节细胞减少;中药组和西药组视网膜各层排列较整齐，有轻微组织水肿，未见毛细血管扩张。DM6月视网膜HE染色:DM模型组的视网膜各层结构不清晰，节细胞减少，有空泡形成;内核层细胞明显排列紊乱，周围水肿更明显，毛细血管明显扩张。中药组和西药组视网膜轻微水肿，细胞排列紊乱，可见内皮细胞增生。(3)DM3月视网膜消化铺片:正常组毛细血管分布规则，走向较直，血管径粗细均匀;DM模型组毛细血管网排列紊乱，基底膜部分略增厚，周细胞减少，内皮细胞开始增生;中药组及西药组血管铺片表现接近正常组，毛细血管分布较规则，周细胞、内皮细胞分布排列基本规律。DM6月视网膜消化铺片:DM模型组毛细血管分布紊乱，有扭曲聚集等现象，部分毛细血管扩张，并可见微血管瘤、影周细胞、无细胞毛细血管散在分布。中药组的视网膜毛细血管得到明显的保护，未见扭曲聚集现象，毛细血管轻微扩张，内皮细胞、周细胞分布排列比较规律;西药组对视网膜的保护作用不如中药组。(4)眼底照相和血管荧光造影提示:SD大鼠受到迅速的涡静脉和脉络膜血管的背景荧光干扰，视网膜血管显影不清晰;正常BN组大鼠毛细血管清晰;而DM6周的BN大鼠，血管荧光造影均出现静脉迂曲、微动脉瘤、荧光素渗漏等病理表现。
　　2.对血——视网膜屏障保护的影响:(1)DM3月的模型组SD大鼠伊文思蓝(EB)渗漏量与正常组比明显升高，差异具有显著统计学意义(P＜0.05);中药组和西药组的EB渗漏量明显降低，与正常组比差异具有显著统计学意义(P＜0.05)。(2)DM模型组大鼠视网膜ZO-1、Occludin以及Claudin-5的表达量较正常组明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05);与DM模型组相比，中药组视网膜组织ZO-1表达量明显升高，差异具有显著统计学意义(P＜0.05)，而西药组ZO-1表达有升高趋势，但无显著性差异(P＞0.05);中药组和西药组视网膜组织Occludin表达明显升高，差异有显著统计学意义(P＜0.05);西药组视网膜组织Claudin-5表达量明显升高，差异具有显著统计学意义(P＜0.05)，而中药组Claudin-5表达有升高趋势，但无显著性差异(P＞0.05)。
　　3.对改善血管内皮功能的作用机理:(1)TUNEL检测显示DM模型组大鼠凋亡的视网膜细胞比正常组明显增加，差异具有统计学意义(P＜0.05);中药组和西药组大鼠视网膜细胞凋亡细胞较DM组明显减少，差异具有统计学意义(P＜0.05)。(2)DM模型组视网膜VEGF和VEGFR表达量与正常组相比明显升高，差异具有显著统计学意义(P＜0.05);与DM模型组相比，中药组与西药组VEGF表达量明显降低，差异具有显著统计学意义(P＜0.05);与DM模型组相比，中药组和西药组VEGFR表达量均有降低趋势，但差异无统计学意义(P＞0.05)。(3)DM模型组视网膜组织PEDF表达量与正常组比明显降低，差异具有显著统计学意义(P＜0.05);中药组视网膜PEDF表达量比DM模型组明显升高，差异具有显著统计学意义(P＜0.05);西药组PEDF表达量比模型组有上升趋势，但无显著统计学差异(P＞0.05)。(4)与正常组比较，DM模型组Ang-1和Tie-2表达明显降低，差异具有显著统计学意义(P＜0.05);与DM模型组比较，中药组Ang-1和Tie-2表达与模型组比明显升高，差异具有显著统计学意义(P＜0.05);西药组Ang-1和Tie-2表达有上升趋势，但无显著统计学差异(P＞0.05)。(5)与正常组比较，DM模型组miR-200b的表达量与正常组比明显降低，差异有显著统计学意义(P＜0.05);中药组和西药组miR-200b相对表达量较DM模型组明显升高，差异具有显著统计学意义(P＜0.05)。
　　研究结论:1.链脲佐菌素诱导的SD大鼠糖尿病病程达12周时，大鼠视网膜出现早期DR的病理改变;随着糖尿病病程延长，视网膜病理改变逐渐加重。2.糖尿病大鼠视网膜病变发生前预防性给予益气温阳通络方，可缓解大鼠DR的病理表现，减少伊文思蓝渗漏量，从而保护血—视网膜屏障，机制与增加紧密连接蛋白Occludin与ZO-1表达有关。3.益气温阳通络方预防DR的机制可能通过调控miR-200b的表达，抑制VEGF表达，上调PEDF、Ang-1、Tie-2等关键靶基因的表达，从而改善视网膜内皮功能障碍，预防DR的发生。4.益气温阳通络方还可能通过调控NF-κB和p38-MAPK通路，降低ICAM-1的表达，同时降低TNF-α表达的趋势，抑制炎症状态，预防DR的发生。5.益气温阳通络方可改善胰腺病理形态，显著增加胰岛素阳性表达，减少胰高血糖素阳性表达，可能具有保护胰岛功能的趋势。

目录

声明

摘要

英文缩略词

前言

第一部分文献综述

一、糖尿病视网膜病变的中医认识

二、MicroRNA在糖尿病视网膜病变中的应用

第二部分益气温阳通络方对糖尿病大鼠视网膜病理形态的影响

材料和方法

2．1实验材料

2．2实验方法

2．3实验结果

2．4章节讨论

2．5小结

第三部分益气温阳通络方对糖尿病大鼠血——视网膜屏障通透性的影响

材料和方法

3．1实验材料

3．2实验方法

结果和讨论

3．3研究结果

3．4章节讨论

3．5小结

第四部分基于MicroRNA-200b调控血管内皮功能探讨益气温阳通络方预防糖尿病大鼠视网膜病变的作用及其机制

材料和方法

4．1实验材料

4．2实验方法

结果和讨论

4．3研究结果

4．4章节讨论

4．5小结

第五部分基于保护胰岛细胞功能角度探讨益气温阳通络方预防糖尿病大鼠视网膜病变发生的作用及其机制

材料和方法

5．1实验材料

5．2实验方法

结果和讨论

5．3实验结果

5．4章节讨论

5．5小结

第六部分结论

创新点

不足与展望

参考文献

致谢

个人简历