肺炎链球菌荚膜多糖血清型3结合疫苗的研制及免疫原性的研究

摘要

肺炎链球菌所引发的疾病在全球的发病率和死亡率非常高，人数最多的是老人和儿童。已有实验证明其荚膜多糖是TI抗原，再次免疫不能使降低的抗体达到初次免疫的水平，不能诱导免疫记忆细胞的产生。若将其共价连接到蛋白却使之成为TD抗原，能够对婴幼儿和老人产生抗体，免疫效果会得到提高。因此研究肺炎链球菌多糖蛋白结合疫苗具有重要意义。
　　论文以3型肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合工艺的研究为对象，通过对3型荚膜多糖水解预处理，分子筛，氧化醛基，超滤，共价结合CRM197蛋白，SDS-PAGE电泳，液相纯化工艺流程研制结合疫苗，并通过动物免疫实验观察免疫原性。
　　首先研究了多糖水解预处理方法，从不同水解温度和不同水解时间两个方面，通过分子筛的测定，发现随着温度和时间的增加，分子量变得越来越小。在85℃下用0.2mol/L乙酸溶液水解1.0h，可以得到分子量较大的结合产物，游离蛋白很少;其次多糖活化过程中发现活化反应16h以后，多糖溶液中高碘酸钠基本已经反应完全。随着加入高碘酸钠的浓度升高，活化度降低，超滤后的多糖回收率也逐渐降低。加入0.4g/L高碘酸钠，活化度为10左右，活化多糖的回收率在78％左右;然后结合过程中，通过从反应体系容器，结合反应时间，投料比，多糖和蛋白回收率四个方面的优化研究结合疫苗，发现在4mL体系中选用50mL离心管，多糖和蛋白的投料比为20∶10，加入7倍醛基含量的氰基硼氢化钠，在37℃下反应48h时，利用SDS-PAGE电泳，液相纯化和超滤可以获得收率较高，没有游离蛋白的大分子量结合产物;最后纯化后的结合产物用高压灭菌的生理盐水和5mmol/L pH5.8琥珀酸缓冲液配制成疫苗，通过BALB/C小鼠免疫实验研究发现，85℃下水解1.0h多糖，活化度10左右时，多糖蛋白投料比为20∶10时获得的结合疫苗免疫原性相对来说最好。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 肺炎链球菌肺炎疾病的概述

1．1．1 肺炎链球菌概述

1．1．2 肺炎链球菌所致疾病

1．1．3 肺炎链球菌致病机制及机体反应

1．1．4 肺炎链球菌疾病的流行病学

1．1．5 肺炎链球菌肺炎的诊断和防控现状

1．2 肺炎链球菌疫苗进展

1．3 肺炎链球菌多糖疫苗

1．4 肺炎链球菌多糖蛋白疫苗

1．4．1 结合疫苗概述

1．4．2 结合疫苗的免疫机理

1．4．3 肺炎结合疫苗的国内外进展

1．4．4 结合疫苗的结合化学

1．4．5 结合疫苗的指标控制

1．5 载体蛋白

1．6 本论文的研究目的和主要内容

1．6．1 本论文的研究目的

1．6．2 本论文的主要研究内容

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 多糖发酵液与载体蛋白

2．1．2 实验主要试剂

2．1．3 主要实验仪器

2．1．4 实验动物

2．1．5 实验主要溶液的配制

2．2 实验方法

2．2．1 肺炎链球菌血清型3型多糖发酵液的纯化方法

2．2．2 纯化多糖中醛酸的检测方法

2．2．3 活化多糖产生的醛基检测方法

2．2．4 多糖浓度的检测方法

2．2．5 蛋白浓度的检测方法

2．2．6 HPSEC-MALS-RI联用系统测定多糖和多糖蛋白结合物分子量及分子大小分布

2．2．7 多糖蛋白结合产物分布的鉴定方法

2．2．8 多糖蛋白结合产物的纯化方法

2．2．9 免疫血清效价的检测方法

2．3 多糖水解研究

2．3．1 不同水解温度对3型多糖分子量的影响

2．3．2 不同水解时间对3型多糖分子量的影响

2．4 多糖活化研究

2．4．1 活化反应时间对3型多糖性质的影响

2．4．2 不同高碘酸钠浓度对3型多糖活化度的影响

2．4．3 活化度对多糖回收率的影响

2．5 多糖蛋白结合工艺研究

2．5．1 结合工艺中条件的控制研究

2．5．2 不同水解温度处理的3型多糖与CRM197在水相中的结合

2．5．3 不同水解时间处理的3型多糖与CRM197在水相中的结合

2．5．4 不同活化度的3型活化多糖与CRM197在水相中的结合

2．6 多糖蛋白结合物免疫原性的研究

2．6．1 不同水解温度处理的结合产物的免疫原性

2．6．2 不同水解时间处理的多糖蛋白结合产物的免疫原性

2．6．3 不同活化度多糖蛋白结合产物的免疫原性

3 结果与讨论

3．1 纯化多糖检测结果

3．2 标准曲线结果

3．2．1 多糖检测标准曲线

3．2．2 蛋白检测标准曲线

3．2．3 醛基检测标准曲线

3．3 多糖水解研究结果

3．3．1 不同水解温度分子量

3．3．2 不同水解时间分子量

3．3．3 水解小结

3．4 多糖活化研究结果

3．4．1 活化反应时间的影响

3．4．2 不同高碘酸钠浓度对3型多糖活化度的影响

3．4．3 活化度对活化过程中多糖收率影响

3．4．4 膜包孔径对多糖回收工艺的影响

3．4．5 活化反应小结

3．5 多糖蛋白结合结果

3．5．1 结合工艺中条件的控制研究

3．5．2 不同水解温度多糖结合的结果

3．5．3 不同水解时间多糖结合的结果

3．5．4 不同活化度多糖结合结果

3．5．5 结合比的比较

3．5．6 结合反应小结

3．6 多糖蛋白结合物免疫原性研究

3．6．1 不同水解温度结合物免疫原性结果

3．6．2 不同水解时间结合物免疫原性结果

3．6．3 不同活化度结合物免疫原性结果

3．6．4 不同投料比结合物免疫原性结果

3．6．5 结合产物免疫原性小结

4 结论

5 展望

参考文献

7 攻读硕士研究生学位期间发表论文情况

致谢