家蚕性连锁平衡致死系致死基因l和l的精细定位

摘要

家蚕性连锁平衡致死系(S14)是俄罗斯科学家V.A.Strunnikov等运用辐射诱变等手段培育而成的,品系两条Z染色体上分别带有一个隐性致死突变基因l1和l2(lethal gene1,l1和lethal gene2,l2),l1,和l2为非等位基因,致死时期分别是转青期和反转期终了,两个致死基因之间的交换率为0.8％。S14品系的W染色体上易位有一个包含+os显性性状基因的Z染色体片段,易位片段携带l1的正常等位基因,可以掩盖l1的致死作用。因此S14品系,W+l1 Z+l1.l2基因型雌蚕卵和Zl1.+l2/Zl1.+l2基因型雄蚕卵分别因l2和l1致死作用在胚胎期死亡；W+l1 Zl1+l2基因型雌蚕卵和Zl1.+l2/Z+l1.l2基因型雄蚕卵存活发育成成虫。将S14品系的雄蛾与P50品系的雌蛾杂交,F1代雄蛾再与P50品系雌蛾回交。回交一代雌蛾根据父本(F1代雄蛾)携带l1或l2分成两类BCl-l1和BCl-l2两个回交种群,分别用来定位,l1和l2致死基因。
　　 本研究的内容与结果:
　　 (1)已知os油蚕基因和l1致死基因连锁。据文献报道分子标记N20.80b与os油蚕性状标记连锁,N20.80b位于Z染色体精细物理图谱19.2 Mb位点附近,从家蚕全基因组数据库KAIKObase中下载N20.80b附近长5.7 Mb的Z染色体基因组序列。使用SSRHunter1.3软件对5.7 Mb基因组序列进行SSR标记搜寻,并根据SSR标记两端的单一序列设计上下游引物,共设计563对SSR特异性引物。
　　 (2)为筛选能区分S14品系Zl1.+l2/Z+l1.l2两条Z染色体的差异标记,用563对SSR特异性引物检测S14品系雌蛾与雄蛾基因组间的多态性,共获得10个差异标记,这些差异标记用以鉴定F1代雄蛾携带l1或l2。用563对SSR引物检测杂交F1代雄蛾基因组的多态性,分别筛选P50品系的Z染色体与S14品系系Zl1.+l2和Z+l1.l2条Z染色体的差异标记,其中P50的Z染色体和系Zl1.+l2染色体之间有16个差异标记,和系Z+l1.l2染色体之间有18个差异标记,这些差异标记分别用于BCl-l1和BCl-l2雌蛾基因型的检测。
　　 (3)通过对作图群体BCl-l1和BCl-l2雌蛾基因型的检测,分别构建了l1、l2致死基因和SSR标记之间的连锁图,结合SSR标记在Z染色体物理图谱中的位置,最终l1基因定位在物理图谱19.79 Mb位点到染色体末端(长约2.6 Mb)范围内；l2基因定位在物理图谱17.86 Mb位点到18.55 Mb位点(长约0.69 Mb)范围内。通过对比l1和l2的连锁图,发现5.7 Mb范围内Zl1.+l2染色体与P50 Z染色体间交换率0.82％,而Z+l1.l2染色体与P50 Z染色体间交换率9.28％,推测携带l1的Zl1.+l2染色体可能存在结构异常,从而抑制了Zl1.+l2染色体和P50 Z染色体在5.7 Mb范围内的重组交换。
　　 (4)用位于l1定位的2.6 Mb区域的183对引物检测Zl1.+l2/Zl1.+l2基因型死亡胚胎、W+l1 Zl1.+l2基因型和Zl1.+l2/Z+l1.l2基因型存活胚胎三种基因组发现,携带l1的Zl1.+l2染色体缺失了末端大小约0.184 Mb的片段,而携带+l1的W+l1染色体携带Zl1.+l2染色体缺失的0.184 Mb片段。推测Zl1.+l2染色体缺失的0.184 Mb片段上有家蚕存活的必须基因,Zl1.+l2/Zl1.+l2基因型胚胎因必须基因缺失在转青期死亡。通过生物信息学方法对KAIKObase数据库预测的0.184 Mb片段内的功能基因进行分析,推测Pdpl基因(BGIBMGA003874)可能是致死基因l1的候选基因之一。

目录

文摘

英文文摘

基金项目

1 文献综述

1.1 基因定位策略

1.1.1 家系分析

1.1.2 细胞水平

1.1.3 染色体水平

1.1.4 分子水平

1.2 家蚕遗传图谱及Z染色体上的遗传标记

1.2.1 家蚕的经典遗传图

1.2.2 家蚕的分子遗传图

2 引言

2.1 研究背景和意义

2.2 研究内容

2.3 技术路线

3 实验材料、设计与方法

3.1 实验材料

3.1.1 材料蚕品种及组配

3.1.2 主要试剂

3.1.3 常用溶液的配制

3.1.4 主要仪器设备

3.2 实验设计

3.2.1 S14品系内Z染色体多态性标记筛选

3.2.2 致死基因I1和I2各自所在染色体的分子鉴别

3.2.3 致死基因I1和I2的定位

3.2.4 利用生物信息学预测的致死基因I1和I2候选基因

3.3 实验方法

3.3.1 单蛾基因组DNA的提取

3.3.2 单卵基因组DNA抽提

3.3.3 模板DNA的制备

3.3.4 PCR扩增和琼脂糖电泳检测

3 .3.5致死基因I1和I2的连锁分析

3.3.6 致死基因定位分析

3.3.7 致死基因I1所在Z11,+12染色体缺失鉴定

3.3.8 致死基因I1和I2候选基因的预测

4 结果与分析

4.1 区分两条Z染色体的分子标记的筛选

4.1.1 S14品系雌雄蛾间多态性筛选

4.1.2 致死基因I1和I2所在Z染色体多态性的单卵验证

4.2 P50的Z染色体和S14的ZL1,+L2或Z+L1,L2染色体之间多态性标记的筛选

4.2.1 利用BC1胚胎死亡时期鉴别其父本F1代雄蛾的基因型

4.2.2 F1代雄蛾基因型的分子鉴别

4.2.3 F1代雄蛾两条Z染色体间多态性标记的筛选

4.3 致死基因L1和L2的定位

4.3.1 致死基因I1的定位

4.3.2 致死基因I2的定位

4.4 致死基因L1和L2的候选区基因分析

4.4.1 致死基因I1缺失区域内基因分析

4.4.2 致死基因I2候选区内基因分析

5 讨论

5.1 Z染色体(S14品系内及其与P50之间)多态性筛选

5.2 致死基因L1所在Z染色体结构异常的探讨

5.3 致死基因的推测

6 小结

参考文献

附录

致谢

在校期间发表论文