结球甘蓝原生质体培养及植株再生

摘要

本试验以结球甘蓝不同熟性的6个品种为材料,对影响其原生质体培养的主要因素进行了探讨；初步建立了适合结球甘蓝原生质体游离、纯化、收集、培养以至再生出完整植株的实用技术体系；为其非对称细胞融合及品种改良与创新等研究奠定了基础。研究结果如下:
　　 1.原生质体的游离条件优化表明:以2％Cellulase R-10+0.5％Pectolase Y-23+9CPW+5mmol／L MES酶液组合的酶解效果最佳。其对4d苗龄的结球甘蓝下胚轴原生质体进行游离纯化,16h后以1000rpm,4min的离心条件对游离的原生质体进行纯化,得到原生质体产量为16.85×105个／g,所获得原生质体活力为86.3％。
　　 2.原生质体培养条件的优化表明:以YP+NAA 0.2mg／L+2,4-D 0.5mg／L+6-BA.0.2mg／L的原生质体培养效果最佳,10d后细胞分裂频率与40d后植板率分别为20.8％和0.53％。采用固液双层培养的方法,细胞分裂频率与液体浅层培养相差不大,但植板率明显大于液体浅层培养法获得的植板率。由MS培养基添加NAA 0.025mg／L+2,4-D 0.025mg／L+6-BA 0.1mg／L对结球甘蓝下胚轴原生质体微愈伤组织增殖效果好。MS培养基附加6-BA 2mg／L,ZT 0.5mg／L对结球甘蓝下胚轴原生质体再生愈伤组织芽分化效果较佳。在结球甘蓝原生质体培养再生植株过程中,往芽分化培养基中添加AgNO37.5mg／L,能明显提高再生绿芽的分化,出芽率由51.3％提高至65.2％,褐化率下降约5个百分点。取生长状态好的再生绿芽,以1／2MS附加IBA 0.2mg／L为生根培养基进行生根培养,能全部生根获得完整再生植株,植株再生率为100％。
　　 3.再生植株差异性检测表明:所获得的QL再生植株,在外观形态上基本与母本植株相同,仅有数株表型略有不同。流式细胞仪细胞倍性检测结果显示,所检测的原生质体再生植株,其中有79.6％为正常二倍体,9.1％为单倍体植株,6.8％为单／二倍体嵌合体植株,4.5％为四倍体植株。用RAPD分子标记技术对所获得的再生植株进行DNA水平的变异性分析,结果表明,结球甘蓝原生质体再生植株与母本植株间平均遗传相似系数为0.8709。
　　 4.在本试验条件下,通过对几个品种的原生质体培养效果比较,初步判定,早熟性品种可能更适合用于进行原生质体培养。