甘蓝型油菜不育基因BnMs3/ms3和BnRf/rf的精细定位以及分子标记辅助选育效率评价

摘要

陈凤祥(1993，1998)提出油菜隐性核不育材料9012A的育性由2对隐性重叠基因和1对隐性上位抑制基因互作控制，并创立了三系杂种利用模式，为隐性核不育杂种优势利用开辟了一条新途径。俎峰(2010)、董发明(2010)、倪西源(2011)一致认为9012A不育系统可能只受2对基因(BnMs3/ms3与BnRf/rf)互作调控。该不育系统具有不育性彻底、稳定且恢复源广等优点，但是育性受多对基因互作控制，分离后代基因型复杂，不易选育，限制了其在杂交育种中的大规模应用。为了确定育性基因和明确其作用机理，加速发挥该不育系统在生产上的应用，我们在徐小栋(2009)对甘蓝型油菜育性基因Bnms3与Bnrf分别定位于280Kb与4Mb的基础上，扩大群体和增加位置特异性标记分别对其进行更为精细的定位，且利用分别与两基因连锁的共显性标记筛选临保系和两型系三种目标基因型，评价标记辅助选育效率并进一步验证和油菜隐性互作核不育系统的遗传模式。实验结果和结论如下:
　　 一、隐性不育基因Bnms3位点的精细定位及共显性连锁标记的开发
　　 在徐小栋(2009)对Bnms3定位至280Kb基础上，根据白菜基因组A10序列，设计位置特异性引物58对，利用BSA法筛出16个标记与Bnms3紧密连锁，经在2490个分离单株中分析确认，与Bnms3基因为零交换的有8个标记(Sca08-6、Ms3-66、Ms3-81、Ms3-82、Ms3-89、Ms3-93、Ms3-95、Ms3-96)，对应5个基因(At5g16560，At5g16570，At5g16590，At5g16600和At5g16640)，标记Ms3-74和Ms3-88分别位于Bnms3两侧，在2490个检测单株中，分别只有2个和1个交换株，两标记间物理距离为75Kb，含9个ORFs。较徐小栋定位结果(280Kb)缩小了约200Kb。此外，本研究中还筛选出与Bnms3相邻0.05cM的范围内的共显性标记6个(Ms3-77、Ms3-82、Ms3-88、Ms3-89、Ms3-93、Ms3-95)，可有效地应用于标记辅助选取育。
　　 二、隐性上位基因Bnrf的定位研究及共显性连锁标记的开发
　　 在徐小栋(2009)将Bnrf位至4Mb区基础上，根据白菜基因组A7序列，新发展81对标记，并整合前人研究中的4个标记，利用BSA法筛出10对标记与Bnrf密连锁，先在576株单株的wy23-rf(9012A)群体中完成Bnrf的初定位，距Bnrf最近两侧标记为Sca17-5和Sca17-25。进而，在这两标记对应白菜基因组A7序列片段上，设计位置特异性引物85对，并扩大定位群体至1767株精细定位Bnrf,发现有16个标记与Bnrf紧密连锁。Sca17-(61-87)-13和Sca17-(61-87)-27为距Bnrf近两侧标记，物理距离约为99.3Kb，大大缩短了徐小栋4Mb的定位结果。同时利用1099个单株的MSL-r群体，从定位Bnrf所用的170个标记中获得10个与Bnrf紧密连锁，同样，Sca17-(61-87)-13和Sca17-(61-87)-27为距Bnrf近两侧标记。此外，本研究中还筛选出与Bnrf锁共显性标记7个(MR166、Sca17-5、Sca17-25、Sca17-61、Sca17-75、Sca17-87、Sca17-(61-87)-27)为分子标记辅助油菜选育提供了重要的工具。
　　 三、甘蓝型油菜隐性核不育材料遗传模式的验证以及标记辅助选育效率评价
　　 研究以20118A和MSL系统不育系和临保系以及分别与22个油菜品种（系）杂交测交后代为材料，同时采用经典遗传学和分子标记辅助选择方法。研究表明:6个品种（系）与20118A/MSL-A测交产生的F2世代育性调查，所有组合可育株∶不育株比例均符合3∶1或13∶3分离规律，而与20118A-TAM/MSL-TAM杂交产生的8个F2均为全可育，证明育性符合1对隐性不育基因和1对隐性上位抑制基因互作控制的遗传模式;进而采取反向验证方法，从925个F2分离单株中，用新发展的Bnms3/Bnrf连锁共显性标记跟踪选择，直接获得临保系(ms3ms3rfrf)、纯合不育株(ms3ms3RfRf)和两型系可育株(Ms3ms3RfRf)63、64和110株，经测交或互交验证，准确率均达95％以上;根据22个测交品种的后代分离，BnRf位点上只发现Rf和矿两个等位基因，推测前人提出的第3个等位基因存在的频率很低，基本可以根据2基因各2等位基因互作原理开展分子标记辅助育种;20118A和MSL系统临保系和纯合不育系间交叉配组，后代育性分离结果显示来源于中国和德国NPZ育种公司的这两个不育系统实际受相同的2对基因互作控制。

目录

摘要

第一章 文献综述

1 油菜的杂种优势利用现状

2 油菜杂种优势利用的途径

2．1 细胞质雄性不育

2．2 细胞核雄性不育

2．3 细胞核+细胞质雄性不育

2．4 生态型雄性不育

2．5 自交不亲和

2．6 化学杀雄

2．7 其它利用途径

3 油菜细胞核雄性不育的研究

3．1 一对复等位基因控制的细胞核雄性不育

3．2 两对显性基因互作控制的细胞核雄性不育

3．3 两对隐性基因控制的细胞核雄性不育

3．4 隐性上位基因互作控制的细胞核雄性不育

4 分子标记的开发及遗传图谱的构建

4．1 常用的分子标记

4．2 位置特异性分子标记发展策略

4．3 分子标记遗传图谱的构建

5 甘蓝型油菜育性相关重要基因的定位及应用

5．1 甘蓝型油菜隐性核不育(9012A)基因Bnms3的定位

5．2 甘蓝型油菜隐性核不育上位性基因Bnrf的定位

5．3 分子标记在油菜选育中的应用

6 本研究的内容、目的和意义

第二章 甘蓝型油菜隐性上位互作核不育Bnms3的精细定位

1 Bnms3基因定位材料

2 研究方法

2．1 DNA提取

2．2 标记分析

2．3 标记的发展

2．4 连锁图谱构建

3 结果与分析

3．1 Bnms3基因定位群体

3．2 Bnms3基因连锁标记的筛选

3．3 Bnms3基因的精细定位

3．4 Bnms3基因连锁共显性标记的获得

4 讨论

4．1 Bnms3所在染色体

4．2 Bnms3紧密连锁共显性标记

第三章 甘蓝型油菜隐性上位互作核不育Bnrf基因的定位

1 Bnrf基因定位材料

2 研究方法

2．1 DNA提取

2．2 标记分析

2．3 标记的发展

2．4 连锁图谱构建

3 结果与分析

3．1 Bnrf基因定位群体

3．2 Bnrf基因连锁标记的筛选

3．3 Bnrf基因的初步定位

3．4 Bnrf基因的精细定位

3．5 Bnrf基因共显性标记的获得

4 讨论

4．1 BnRf/rf区间进一步缩小

4．2 Bnrf紧密连锁共显性标记

4．3 标记发展的策略

第四章 分子标记辅助选育及育性遗传模式的验证

1 材料

2 研究方法

2．1 F2世代田间育性调查

2．2 标记基因型的测交验证

2．3 连锁标记筛选

2．4 标记辅助选择

3 结果与分析

3．1 经典遗传学分析

3．2 分子遗传学分析

4 讨论

4．1 20118A的遗传控制体系和Bnrf位点等位基因频率

4．2 MSL与20118A遗传控制系统和等位性比较

4．3 分子标记辅助选育极大提高育种效率和选择准确率

参考文献

附录A 研究用试剂配方

缩写词

攻读学位期间取得的研究成果

致谢