铜绿假单胞菌应答多株噬菌体感染相关基因的筛选及噬菌体C11基因组的功能注释

摘要

噬菌体的感染过程受到宿主菌基因的影响，研究噬菌体感染相关的宿主基因，有助于了解噬菌体与宿主菌相互作用关系，揭示相应的分子机制，为噬菌体的应用提供利用基础。
　　以铜绿假单胞菌PAK为宿主菌，构建转座子Tn5G插入突变株文库，分别与7株铜绿假单胞菌噬菌体O1、O2、K1、K2、K3、C10、C11共培养。共筛选得到30株耐受噬菌体突变株，其中25个突变株对相应噬菌体的吸附率显著降低，显示突变基因可能与噬菌体受体合成途径相关;5个突变株对噬菌体C11的吸附率为100％，显示突变基因与噬菌体吸附过程无关，可能参与噬菌体感染的其它过程。
　　利用反向PCR技术查找突变基因，25株吸附率下降的突变子共发现11个不同基因分别被转座子Tn5G阻断。其中有8个基因参与脂多糖LPS(lipopolysaccharide)的合成:基因wbpO和wbpV分别参与糖基前体物质UDP-GalNAcA和UDP-QuiNAc的合成;基因wbpR、wbpT和wbpL编码糖基转移酶;基因PALES_16971编码的蛋白与大肠杆菌O-抗原聚合酶同源，同源程度为96％。基因PA5001和基因PA5004均编码糖基转移酶，负责脂多糖核心寡糖的组装。其余基因包括:基因PA4367编码蛋白BifA，水解环鸟苷二磷酸;基因PA0583编码2-氨基-4-羟基-6-甲基二氢蝶啶焦磷酸激酶，参与叶酸合成;基因PA5181编码钼氧化还原酶。功能互补实验结果表明，16个基因均能恢复相应突变株对噬菌体的敏感性。
　　5株吸附率不变的突变株，它们被阻断的基因分别为:基因BN889_05221编码75aa小蛋白;基因PA3808编码蛋白可能提供合成硫铁簇所需的硫元素;基因PA1993编码主要超家族转运蛋白(MFS);基因PA0243编码TetR型调节因子;基因PA1115编码硫酸酯酶。
　　噬菌体C11分别与5株吸附率不变突变子共培养，发现随着噬菌体浓度增加，突变子生长速率逐步下降。结果暗示，噬菌体基因组DNA可能注入宿主细胞内，迟滞宿主菌的生长。进一步采用实时定量PCR技术，发现5个突变子内噬菌体基因组能够复制。结果显示，5个突变基因与噬菌体感染过程中的非吸附阶段相关。
　　C11组装基因组大小为93010 bp。实验发现基因组5'末端和3'末端具有相同的正向重复序列，长度为1173bp。修订后基因组大小为94109 bp，编码12个tRNA和172个ORFs。比较基因组学分析，噬菌体C11基因组序列与噬菌体PaP1同源程度为92.41％，并且主要衣壳蛋白氨基酸同源性为100％，噬菌体C11归为PaP1家族的一个新成员。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 铜绿假单胞菌

1．1．1 铜绿假单胞菌概述

1．1．2 铜绿假单胞菌多样性

1．1．3 铜绿假单胞菌耐药性

1．2 铜绿假单胞菌噬菌体

1．2．1 噬菌体分类

1．2．2 铜绿假单胞菌噬菌体治疗研究

1．2．3 铜绿假单胞菌噬菌体全基因测序研究进展

1．3 铜绿假单胞菌噬菌体与铜绿假单胞菌相互作用的关系

1．3．1 宿主菌中与噬菌体感染相关基因的研究进展

1．3．2 铜绿假单胞菌噬菌体受体研究方法

1．3．3 铜绿假单胞菌噬菌体受体分析

1．3．4 铜绿假单胞菌噬菌体感染相关基因的研究进展

1．4 论文研究意义和研究内容

1．4．1 研究意义

1．4．2 研究内容

2 材料和方法

2．1 实验菌株、质粒及噬菌体

2．2 引物

2．3 铜绿假单胞菌感染相关基因的遗传分析

2．3．1 转座子文库构建及耐受噬菌体突变株的筛选

2．3．2 菌株对噬菌体敏感性测定

2．3．3 突变株的噬菌体吸附率测定

2．3．4 突变株与噬菌体的共培养实验

2．3．5 反向PCR鉴定Tn5G插入位点

2．3．6 回复实验

2．3．7 定量PCR

2．4 噬菌体C11电镜分析

2．5 噬菌体C11一步生长曲线测定

2．6 噬菌体C11基因组测序样品的制备及测序

2．7 噬菌体C11基因组末端序列的发现与确定

2．8 噬菌体C11基因组序列分析

2．9 噬菌体C11基因组注释

3 结果与讨论

3．1 利用转座子Tn5G筛选耐受噬菌体突变株

3．1．1 噬菌体O1的耐受突变株筛选

3．1．2 噬菌体O2的耐受突变株筛选

3．1．3 噬菌体K1的耐受突变株筛选

3．1．4 噬菌体K2的耐受突变株筛选

3．1．5 噬菌体K3的耐受突变株筛选

3．1．6 噬菌体C10的耐受突变株筛选

3．1．7 噬菌体C11的生物学特性以及耐受突变株筛选

3．2 耐受噬菌体突变株表型分析

3．2．1 突变株对噬菌体敏感性的确定

3．2．2 噬菌体吸附率确定

3．3 噬菌体感染必需宿主基因的分析

3．3．1 噬菌体O1感染必需宿主基因的分析

3．3．2 噬菌体O2感染必需宿主基因的分析

3．3．3 噬菌体K1感染必需宿主基因的分析

3．3．4 噬菌体K2感染必需宿主基因的分析

3．3．5 噬菌体K3感染必需的宿主基因的分析

3．3．6 噬菌体C10感染必需的宿主基因的分析

3．3．7 噬菌体C11感染必需的宿主基因的分析

3．4 基因功能互补实验

3．4．1 基因PA4367的功能互补实验

3．4．2 基因PA0583的功能互补实验

3．4．3 基因PA5004的功能互补实验

3．4．4 基因BN889_05221的功能互补实验

3．4．5 基因wbpR的功能互补实验

3．4．6 基因PA3808的功能互补试验

3．4．7 基因PA1993的功能互补实验

3．4．8 基因PA5181的功能互补实验

3．4．9 基因PA0243的功能互补实验

3．4．10 基因PA1115的功能互补实验

3．4．11 基因PALES_16971的功能互补实验

3．4．12 基因PA5001的功能互补实验

3．4．13 基因wbpT的功能互补实验

3．4．14 基因wbpO的功能互补实验

3．4．15 基因wbpL的功能互补实验

3．4．16 基因wbpV的功能互补实验

3．5 非受体基因相关功能的研究

3．5．1 噬菌体C11对吸附率不变的突变株的生长影响

3．5．2 基因BN889_05221、基因PA3808、基因PA1993、基因PA5181、基因PA0243、基因PA1115的功能分析

3．6 噬菌体C11的基因组注释

3．6．1 噬菌体C11基因组DNA测序样品分析

3．6．2 噬菌体C11基因组末端序列的发现与确定

3．6．3 噬菌体C11基因组的一般特征注释

3．6．4 噬菌体C11基因组编码基因分析

3．6．5 噬菌体C11的比较基因组学分析

4 结论

5 展望

参考文献

7 攻读硕士学位期间发表论文情况

致谢

9 附录