柑橘类植物ERF6和GRAS基因的低温胁迫应答及启动子序列分析

摘要

低温是影响经济作物产量和品质的主要环境因素之一。柑橘属（Citrus）植物是我国的一类重要的经济作物，其用途非常广泛，即可鲜食也可制药。柑橘在我国的种植面积非常大，但由于是亚热带植物，耐寒性差，周期性的植物冷害严重制约了柑橘的栽培范围。人们一直致力于利用转基因育种等方法提高植物的抗寒能力。转录因子蛋白在植物的非生物胁迫应答中起着重要的作用。ERF和GRAS是植物中所特有的两类参与非生物逆境胁迫的转录因子。佛手、本地早、瓯柑和处红柚是四种耐寒性不同的柑橘属植物，枳是与柑橘亲缘关系很近的一个耐寒性很高的物种。本文以佛手、本地早、瓯柑、处红柚和枳的两年生盆栽苗为试材，研究ERF6、GRAS转录因子的表达差异与植株抗寒性能力强弱的关系，并在佛手中克隆这两种转录因子的启动子序列，初步分析其转录调控机制。
　　1.以两年生佛手（C.medica cv.Qingpi）、本地早(C.reticulata cv.Succosa)、瓯柑(C.reticulata cv.Suavissima)、处红柚(C.maxima cv.chuhongyou)和枳（Poncirus trifoliate Raf.）盆栽苗为试材，经不同温度低温胁迫24小时后，测定叶片的电解质外渗率(REC)，进行植株抗寒性分析和低温半致死温度(LT50)的计算;在-4℃低温胁迫下设置不同的胁迫时间，测定叶片中丙二醛(MDA)的含量，进行植株的抗寒能力强弱比较。结果表明:佛手等五种植株的电解质外渗率随温度降低的上升幅度不同，但上升的趋势线都呈S型曲线，佛手、本地早、瓯柑、处红柚和枳的低温半致死温度分别为-5.2℃、-8.6℃、-8.3℃、-6.6℃和-10.0℃;-4℃低温胁迫下，随着时间的延长五种植株的MDA含量都逐渐增加，但增加幅度不同;五种植株抗寒性强弱的顺序在MDA含量测定和电解质外渗率测定中所显示的结果是一致，其抗寒性强弱顺序为枳＞本地早＞瓯柑＞处红柚＞佛手，且抗寒性能力的差异也与所得的各品种的低温半致死温度差异相一致。
　　2.以佛手、本地早、瓯柑、处红柚和枳的两年生盆栽苗为试材，4℃低温胁迫处理不同时长，采用实时荧光定量PCR的方法检测ERF6和GRAS基因在不同胁迫时间下的mRNA表达差异，分析五种植株中这两种转录因子的表达差异和抗寒能力强弱的关系，明确ERF6和GRAS基因对柑橘类植物低温胁迫应答的作用。结果表明:低温胁迫下五种植株的ERF6和GRAS基因表达量均被诱导上调;佛手ERF6基因低温胁迫12小时内表达量呈上升趋势，上升幅度为对照(0h)的4.3倍，12小时后表达量逐渐下降，48小时后恢复到对照水平;本地早、瓯柑、处红柚和枳ERF6基因均在36小时内表达量上调，上调幅度分别为对照的61，62，6和316倍，36小时后表达量下降;佛手、本地早和枳GRAS基因低温胁迫36小时内表达量上调，上调幅度分别为对照的9.6，408和1506倍，处红柚和瓯柑GRAS基因分别在12，24小时内表达量增加为对照的16和1200倍。说明ERF6和GRAS基因表达量的上调与植株的低温胁迫应答反应有关，基因表达量上调幅度的大小与植株的抗寒能力强弱呈正相关关系。
　　3.以青皮佛手两年生盆栽苗为试材，提取叶片基因组DNA，采用Tail-PCR的方法克隆转录因子ERF6和GRAS基因启动子序列，并进行序列分析。根据已经获得的佛手ERF6基因cDNA全长序列和GRAS基因cDNA全长序列设计下游特异引物进行启动子序列克隆。克隆获得的ERF6基因启动子序列长为847bp，GRAS基因启动子序列长为999bp。利用PLACE数据库对克隆得到的启动子序列进行功能预测，发现序列中含有多种高等植物基因启动子的保守功能元件。其中ICE1 binding site、CBFs binding site和LTR是与植物低温胁迫应答有关的顺式作用元件，说明佛手ERF6和GRAS基因参与佛手对低温胁迫的应答反应。
　　由上述结果可认为，低温诱导佛手ERF6、GRAS基因的表达，这两个转录因子参与佛手等柑橘类植物的低温胁迫应答，作为冷应答基因的转录调控因子或冷应答基因本身提高植物的抗寒功能。

目录

论文说明

摘要

1．柑橘类植物抗寒性研究现状

1．1 柑橘抗寒性生理生化研究

1．2 柑橘抗寒性分子研究

2．转录因子结构及作用机制

2．1 转录因子的结构特征

2．2 转录因子的作用机制

3．ERF、GRAS转录因子功能

3．1 ERF转录因子的功能

3．2 GRAS转录因子的功能

4．研究的目的及意义

第一章 低温胁迫下佛手、本地早、瓯柑、处红柚和枳等五种柑橘类植物半致死温度的测定和抗寒性分析

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2．结果与分析

2．1 不同低温处理下佛手、本地早、瓯柑、处红柚和枳电解质渗出率及半致死温度

2．2 不同处理时间对MDA含量的影响

3 讨论

3．1 电解质外渗率和半致死温度与植株抗寒性的关系

3．2 MDA含量与植株抗寒性的关系

第二章 低温胁迫五种柑橘类植物ERF6、GRAS基因的低温胁迫应答

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果与分析

2．1 总RNA的提取

2．2 cDNA的合成

2．3 ERF6在佛手、本地早、瓯柑、处红柚和枳中低温胁迫下表达量变化分析

2．4 GRAS在佛手、本地早、瓯柑、处红柚和枳中低温胁迫下表达量变化分析

3．讨论

3．1 ERF6基因差异表达与植株的抗寒性关系

3．2 GRAS基因差异表达与植株的抗寒性关系

第三章 青皮佛手ERF6、GRAS基因启动子克隆及序列分析

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2．结果与分析

2．1 基因组DNA提取

2．2 ERF6、GRAS基因启动子序列的PCR扩增

2．3 ERF6、GRAS基因启动子序列测定及分析

3．讨论

结论与展望

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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