水稻类病变新基因CHL1(chloroplastic-H2O2-induced Lesion1)

摘要

水稻类病变突变体(Rice lesion mimic mutant)是指一类在没有明显病原物侵染、逆境或机械损伤的情况下，就能在叶片上自发形成类似病原物侵害的坏死病斑的水稻突变体。水稻类病变突变体是一类重要的遗传材料，对探究水稻细胞程序性死亡、过敏性反应以及抗病调控等的机理具有重要意义。本研究通过筛选粳稻品种浙粳22的EMS诱变突变体库，获得了一个水稻类病变突变体，研究发现其叶片病斑表型是由叶绿体内H2O2诱导形成，因此暂命名该突变体为chl1（chloroplastic-H2O2-induced lesion1）。本研究对chl1的形态表型、生理性状、病斑形成机理进行了初步研究，并克隆了CHL1基因，为该基因的功能研究及其在抗病育种中的利用提供了重要的基础。主要结果如下:
　　1.抗病鉴定表明突变体chl1对稻瘟病和白叶枯病的抗性明显强于其野生型。chl1植株较野生型略矮小，且在生长过程中其叶片会自发产生红褐色病斑，从三叶期开始一直伴随植株生长。
　　2.与野生型相比，chl1叶片病斑处的叶绿体明显肿胀，淀粉粒增多，线粒体呈现明显的空泡化，台盼蓝（trypan blue，TB）染色明显，表明chl1的抗病性和病斑表型是其叶片细胞程序性死亡的结果。同时，chl1叶片二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)染色明显，表明其叶片中H2O2大量积累。结合已有文献，该结果说明H2O2诱导了chl1叶片细胞的程序性死亡。
　　3.遮光实验表明chl1的病斑形成、TB和DAB染色均依赖于光，且DAB染色于叶绿体中，说明光诱导了H2O2积累和细胞程序性死亡。叶绿素荧光参数、光合参数和光合关键酶活性的测定表明，chl1的光合关键酶Rubisco的活性明显下降，光合碳同化效率显著降低，而光合电子传递链没有受到明显的损伤。根据这些结果，初步推测chl1病斑形成的机理为:CHL1基因突变导致了光合碳同化相关蛋白的降解而使碳同化效率降低，从而导致光合机构对光能的利用下降，天线色素所吸收的过剩光能诱导了叶绿体内H2O2的积累，H2O2进一步诱导了细胞的程序性死亡。
　　4.遗传分析表明chl1的类病变表型受隐性单基因控制。利用图位克隆技术，初步将CHL1基因定位于第2号染色体上，进一步的精细定位将该目标基因定位于分子标记RM13541和M2之间，基因注释显示该染色体区段包含7个预测基因。这7个预测基因与已知的类病变基因皆不相同，表明CHL1是一个水稻类病变新基因。
　　5.进一步建立了基于第二代基因组测序方法的图位克隆技术平台，并利用该平台对CHL1基因进行了定位和克隆。利用RAD(Restriction-site associatedDNA)测序将CHL1定位于大约3Mb的染色体区间，利用基因组重测序在该区间内筛选到了2个阳性突变位点。结合前面的精细定位，确认其中一个突变位点所在的基因即为CHL1的目标基因，初步分析表明CHL1为一个编码类似铜胺氧化酶的基因。

目录

论文说明

摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1．1 植物过敏性反应

1．1．1 细胞程序性死亡

1．1．2 植物过敏性反应

1．2 水稻类病变突变体

1．2．1 水稻类病变突变体概述

1．2．2 水稻类病变突变体的来源

1．2．3 水稻类病变突变体的发生机制

1．2．4 水稻类病变突变体的抗病性

1．2．5 水稻类病变突变体的基因克隆

1．3 水稻基因图位克隆与第二代基因组测序

1．4 本研究目的及意义

第二章 水稻类病变突变体chl1病斑形成机理的初步研究

2．1 实验材料与试剂

2．2 实验方法

2．2．1 表型鉴定

2．2．2 抗性鉴定

2．2．3 叶片亚细胞观察

2．2．4 TB染色

2．2．5 DAB染色

2．2．6 光照实验

2．2．7 叶绿素荧光参数和光合参数的测定

2．2．8 核酮糖-1，5-二磷酸羧化／加氧酶(Rubisco)活力测定

2．3 实验结果

2．3．1 chl1的表型特征

2．3．2 chl1的抗病性分析

2．3．3 chl1叶片亚细胞结构观察

2．3．4 chl1叶片的TB染色

2．3．5 chl1叶片的DAB染色

2．3．6 遮光实验

2．3．7 chl1的光合作用分析

2．4 讨论

第三章 水稻类病变突变体chl1目的基因的克隆

3．1 实验材料与试剂

3．2 实验方法

3．2．1 遗传分析

3．2．2 初定位分离群体的构建

3．2．3 基因组DNA的提取

3．2．4 BSA法构建DNA混池

3．2．5 分子标记的PCR扩增

3．2．6 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

3．2．7 精细定位

3．2．8 基于第二代基因组测序技术的目的基因克隆

3．2．9 定位区间内突变位点的克隆验证

3．2．10 目的基因突变位点的酶切验证

3．3 实验结果

3．3．1 遗传模式分析

3．3．2 初定位

3．3．3 精细定位

3．3．4 基于第二代基因组测序技术的目的基因克隆

3．3．5 CHL1的目的基因

3．4 讨论

第四章 结论与展望

4．1 主要结论

4．2 创新之处

4．3 下一步实验计划

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间取得的研究成果

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