嗜碱芽胞杆菌碱性蛋白酶的高效表达及应用

摘要

由于碱性蛋白酶具有催化反应速度快，无工业污染，适应性宽等优点，被广泛地应用于医药、食品加工、化妆品、洗涤剂、丝纺、毛皮软化等行业。同时，经碱性蛋白酶水解、分离而来的酪蛋白磷酸肽，在食品、医药等行业也扮演着十分重要的作用。所以，为提高碱性蛋白酶的发酵活力，研究其在制备酪蛋白磷酸肽中的应用性能，本研究开展了以下工作:
　　利用PCR技术获得了嗜碱芽胞杆菌B.licheniformis TCCC11006的碱性蛋白酶基因（apr），并将该基因与表达载体pHY-WZX相连接，构建重组表达质粒pHY-WZX-apr。以蛋白酶基因缺失的B.licheniformis H115作为宿主菌，成功构建了一株碱性蛋白酶基因工程菌。经SDS-PAGE检测，重组酶的分子质量为35 kDa左右。在基础发酵培养基中培养56 h后，重组酶的最大酶活达到4910 U/mL，是出发菌株的2.79倍。将重组碱性蛋白酶进行初步纯化后，与市售的1398中性蛋白酶和2709碱性蛋白酶的酶学性质进行比较后，发现在较高的温度和pH环境下，重组碱性蛋白酶的稳定性较好;另外，Mn2+, Mg2+和Ca2+对其都有激活作用，只有少量的金属离子对其有抑制作用。
　　通过正交实验确定了工程菌最佳产酶培养基组成为乳糖50 g/L，豆饼粉40 g/L，氯化铵3 g/L，磷酸盐15 mmol/L，氯化钙0.2 g/L;通过单因素实验确定摇瓶培养条件最佳组合为:种龄16h，接种量为4％，34℃发酵培养56h，发酵酶活达到6963 U/mL，是优化前的1.42倍。
　　分别用三种蛋白酶水解酪蛋白溶液，并测定其水解度大小，发现利用重组碱性蛋白酶水解时，其水解度较高。通过单因素实验和正交实验，确定了最佳水解时间、水解温度、水解pH和酶的添加量分别为2h、50℃、9.5和4000 U/g底物。在最优水解条件下，酪蛋白磷酸肽的得率和N/P摩尔比分别为14.8％和8.47，这为碱性蛋白酶在功能性食品制造方面的应用奠定了良好的基础。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 蛋白酶概述

1．2 碱性蛋白酶定义

1．3 碱性蛋白酶应用

1．3．1 碱性蛋白酶在洗涤剂工业中的应用

1．3．2 碱性蛋白酶在医药工业中的应用

1．3．3 碱性蛋白酶在食品加工行业中的应用

1．3．4 碱性蛋白酶在皮革加工行业中的应用

1．4 碱性蛋白酶研究进展

1．4．1 碱性蛋白酶的主要生产菌

1．4．2 碱性蛋白酶国内外研究进展

1．5 地衣芽胞杆菌表达系统

1．6 乳蛋白源的生物活性肽

1．7 酪蛋白磷酸肽

1．7．1 酪蛋白磷酸肽定义

1．7．2 酪蛋白磷酸肽的结构

1．7．3 酪蛋白磷酸肽理化特性

1．7．4 酪蛋白磷酸肽生理毒性研究

1．7．5 酪蛋白磷酸肽的功能

1．7．6 酪蛋白磷酸肽的制备方法

1．7．7 酪蛋白磷酸肽的分离

1．7．8 酪蛋白磷酸肽质量评价方法

1．8 本论文的研究意义及内容

1．8．1 研究意义

1．8．2 研究内容

2 材料和方法

2．1 实验材料

2．1．1 菌种与质粒

2．1．2 实验试剂

2．1．3 仪器设备

2．1．4 培养基

2．2 实验溶液

2．2．1 核酸电泳溶液

2．2．2 聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液

2．2．3 酶活力测定溶液

2．2．4 酶学性质测定溶液

2．2．5 总磷含量测定溶液

2．2．6 其他溶液

2．3 实验方法

2．3．1 嗜碱芽胞杆菌染色体DNA提取

2．3．2 琼脂糖凝胶电泳

2．3．3 重组质粒的构建

2．3．4 枯草芽胞杆菌感受态制备与转化

2．3．5 重组菌WB600／pHY-WZX-apr的筛选与验证

2．3．6 重组质粒pHY-WZX-apr的提取

2．3．7 地衣芽胞杆菌H115感受态制备与电击转化

2．3．8 重组菌H115／pHY-WZX-apr的筛选与验证

2．3．9 SDS-PAGE电泳分析目的蛋白表达情况

2．3．10 重组质粒在地衣芽胞杆菌中的稳定性检测

2．3．11 蛋白酶活测定

2．3．12 酶的分离纯化

2．3．13 重组碱性蛋白酶与两种市售蛋白酶酶学性质的比较

2．3．14 产酶培养基和产酶条件的优化

2．3．15 重组碱性蛋白酶与两种市售蛋白酶水解度的比较

2．3．16 重组碱性蛋白酶水解条件的优化

2．3．17 重组碱性蛋白酶制备酪蛋白磷酸肽

2．3．18 酪蛋白磷酸肽纯度检测

3 结果与讨论

3．1 出发菌株的菌体形态和产酶稳定性

3．1．1 出发菌株菌体形态

3．1．2 出发菌株产酶稳定性

3．2 重组菌B．licheniformis H115／pHY-WZX-apr的构建

3．2．1 嗜碱芽胞杆菌染色体DNA的提取

3．2．2 碱性蛋白酶基因apr的克隆和扩增

3．2．3 质粒pHY-WZX的提取

3．2．4 重组载体的酶切验证

3．2．5 目的基因序列分析

3．3 重组菌且licheniformis H115／pHY-WZX-apr的表达

3．3．1 平板初筛

3．3．2 SDS-PAGE电泳分析

3．3．3 酶活力测定

3．4 重组质粒pHY-WZX-apr在地衣芽胞杆菌中的稳定性

3．5 碱性蛋白酶的分离纯化

3．5．1 盐析

3．5．2 超滤浓缩除盐

3．5．3 重组碱性蛋白酶的纯度鉴定及分子量测定

3．6 重组碱性蛋白酶与市售蛋白酶酶学性质比较

3．6．1 三种蛋白酶最适反应温度的比较

3．6．2 三种蛋白酶的热稳定性的比较

3．6．3 三种蛋白酶最适反应pH的比较

3．6．4 三种蛋白酶pH稳定性的比较

3．6．5 金属离子对三种蛋白酶活力影响的比较

3．7 产酶培养基的优化

3．7．1 不同碳源对产酶的影响

3．7．2 乳糖浓度对产酶的影响

3．7．3 有机氮源种类对产酶的影响

3．7．4 豆饼粉浓度对产酶的影响

3．7．5 无机氮源种类对产酶的影响

3．7．6 氯化铵浓度对产酶的影响

3．7．7 磷酸盐浓度对产酶的影响

3．7．8 发酵优化的正交实验

3．8 摇瓶产酶工艺参数的优化

3．8．1 重组菌生长曲线的测定

3．8．2 种龄对产酶的影响

3．8．3 接种量对产酶的影响

3．8．4 培养温度对产酶的影响

3．9 重组碱性蛋白酶与市售蛋白酶水解度比较

3．10 重组碱性蛋白酶水解条件的优化

3．10．1 温度对水解度的影响

3．10．2 pH值对水解度的影响

3．10．3 酶添加量对水解度的影响

3．10．4 正交实验确定最优水解条件

3．11 重组碱性蛋白酶水解酪蛋白制备酪蛋白磷酸肽(CPP)

3．11．1 酪蛋白磷酸肽得率

3．1 1．2 酪蛋白磷酸肽纯度

4 结论

5 展望

参考文献

7 论文发表情况

致谢