水稻白叶枯病菌磺基转移酶RaxST的活性分析

摘要

水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo)是一种革兰氏阴性病原菌，可诱发水稻产生白叶枯病，严重影响水稻产量。深入研究不同白叶枯病菌小种的发病特点和致病原理，对于培育抗病水稻品种，进而提高水稻产量具有重大意义。
　　Xoo的P6小种(PXO99)不能使含抗病基因Xa2Ⅰ的水稻感病，却会使不含Xa21的水稻感病，说明水稻细胞的Xa21能特异识别PXO99的MAMPs。研究者从PXO99的外泌成分中分离得到了PXO-03968的N端和C端，通过分析其蛋白序列，人工合成酪氨酸硫酸化的多肽axYs22，发现Xa21可与此多肽相互作用，并且Tyr硫酸化是axY22诱导水稻产生抗性所必须的。研究发现在PXO99中，催化其Tyr硫酸化的是磺基转移酶RaxST，以3'磷酸腺苷-5磷酰硫酸(PAPS)为底物，催化PXO-03968或其N端多肽的硫酸化。
　　本研究中，我们克隆、表达、纯化了来自PXO99的RaxST，并对其进行了酶学分析。分析RaxST序列发现，其N端存在一段28个氨基酸的疏水序列。疏水序列的存在可能会使RaxST易与细胞膜的磷脂双分子层结合，可能影响RaxST蛋白的纯化及活性发挥。因此实验中构建了含全长RaxST(fRaxST)的表达载体pET24a-KanP-RaxST、pMALC2E-fRaxST及去掉疏水端序列RaxST(tRaxST)表达载体pMALC2E-tRaxST。将pET24a-KanP-RaxST质粒载体利用电转化方法转入感受态PXO99，经Kan抗性筛选得到阳性重组菌株;将pMALC2E-fRaxST及pMALC2E-tRaxST质粒载体利用热激法转化入E.coli BL21(DE3)。分别利用白叶枯病菌和大肠杆菌表达不同类型的RaxST，用相应的亲和层析法纯化得到相应的fRaxST及tRaxST。
　　PXO-03968(Ax21)、其N端axY22多肽或者更小的多肽均可能是其底物，所以RaxST硫酸化作用的底物并不明确。因此，本实验中构建了Ax21的原核表达载体pMALC2E-PXO-03968，热激法转化入E.coli BL21(DE3)，诱导表达并纯化得到了PXO-03968蛋白。我们利用人工合成的axY22、八肽(AENLSYNF)以及Ax21为底物，对RaxST进行了酶学分析。
　　利用我们实验室建立的酶活测定方法，分别测定RaxST催化不同反应底物的动力学常数。结果表明PXO99表达的fRaxST对17肽axY22的Vm和Km分别为:10.5（±0.5）μM/min和0.26（±0.04）mM;利用Ax21、axY22和八肽(AENLSYNF)为底物，没有检测到大肠杆菌表达fRaxST的磺基转移酶活性。大肠杆菌表达tRaxST磺酸化axY22的Vm和Km分别为7.12（±0.9）μM/min和3.10（±0.2）mM，而没有检测到对Ax21及八肽(AENLSYNF)的磺基转移酶活性。对RaxST的深入分析为深入研究原核生物与宿主的免疫应答及细菌细胞间的信息交流提供了一定理论基础。

目录

论文说明

摘要

缩略词表

第一部分 文献综述

第一章 植物抗病性与病原菌MAMPs的研究

1 LPS与植物天然免疫

2 PGN与植物抗病

3 细菌硫酸化的axYs22与植物抗病

4 其他常见MAMPs的识别

第二章 不同生物磺基转移酶的研究进展

1 动物磺基转移酶的研究进展

2 植物磺基转移酶的研究进展

3 微生物磺基转移酶的研究进展

第三章 本研究的目的及意义

第二部分 实验内容

第一章 RaxST在PXO99中的表达纯化及活性分析

1 前言

2 材料与方法

3 实验结果

4．分析与讨论

第二章 不同长度RaxST在E．coli中的表达纯化及活性分析

1 前言

2 材料与方法

3 实验结果

4 分析与讨论

第三章 PAPS合成相关酶的克隆纯化及活性分析

1 前言

2 材料与方法

3 实验结果

4 结果与讨论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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