不同根际pH处理下蓝莓根系转录组及氮、铁代谢相关基因表达分析

摘要

蓝莓(Blueberry)又名越橘，属杜鹃花科(Ericaceae)越橘属（Vaccinium spp.）植物，是21世纪新兴保健水果。果实富含花青素、黄酮等生物活性物质，具有抗癌、清除自由基和延缓衰老等功能，而备受推崇。但蓝莓对栽培条件苛刻，限制了其在全国范围内大面积种植。非酸性土壤就是影响蓝莓生长发育的一大重要因素。众所周知，蓝莓适宜在土壤pH4.5-5.5之间生长，超过酸性范围易造成蓝莓生长停滞，叶片黄化等现象。虽然前人对蓝莓不适宜非酸性土壤做了大量研究，但都只停留在营养生理学方面，而从分子生物学角度出发探究其分子机理仍鲜见报道。
　　本论文主要包含4个方面的研究内容。首先以‘夏普蓝’（Sharpblue）等5个浙江省主栽蓝莓品种为材料，设置不同pH根际土壤处理，通过生理生化指标分析筛选非酸性土壤适应性最强的蓝莓品种;其次，利用RNA-Seq技术对蓝莓在不同pH处理下的根系进行转录组测序，获得大量转录本序列;接着，分别构建3个表达谱文库（即pH5.0、pH7.0-3d和pH7.0-6d文库），筛选差异表达基因(DEGs)，建立数字基因表达谱;最后，探究了pH和不同氮源形态相互作用对蓝莓生理和氮、铁代谢相关基因表达水平的影响。
　　本研究主要结果如下:
　　1、‘夏普蓝’（Sharpblue）、‘奥尼尔’(O'Neal)、‘Star’、‘布里吉塔’(Brigitta)和‘早蓝’(Earliblue)分剧都在pH5.0、pH7.0和pH7.5根际土壤中处理6个月。研究发现在pH7.0和7.5根际土壤胁迫下，5个蓝莓品种的叶片失绿黄化，根系减少发黑，Fv/Fm、叶绿素含量和根系活力均有不同程度地下降，而根系和叶片的铁螯合还原酶(FCR)活性大体上都呈适应性上升趋势。根据上述结果表明北高丛蓝莓（早蓝和布里吉塔）对中碱性土壤的敏感程度大于南高丛蓝莓(夏普蓝、奥尼尔和Star)，其中适应性最好和最差的蓝莓品种分别是奥尼尔和早蓝。
　　2、蓝莓根系进行转录组测序后，共获得110，098，570个Clean reads，对其进行de nove转录组组装和拼接后，最终得到287，800条Mixed-Unigene，平均序列长度是526 bp，N50值为997nt。将获得的Mixed-Unigene序列与几个已知的公共数据库进行比对，结果发现被NR(NCBI非冗余蛋白数据库)、NT(NCBI非冗余核酸数据库)和Swiss-Prot（去冗余蛋白数据库）分别注释上的序列有127，216、77，897和81，531条。在COG（蛋白质直系同源簇数据库）功能分类中，有59,776条序列被分成了25个类别。KEGG（代谢途径数据库）分析表明，有79，995条Mixed-Unigene序列共参与了129条代谢途径。根据NR注释信息，共有86，806条序列被GO(基因功能分类数据库)的生物学过程（Biological process）、细胞组分(Cellular component)和分子功能(Molecular function)这3个本体进行分类。通过与公共蛋白数据库比对，得到129，972个编码蛋白框(CDS)，其氨基酸序列长度大多小于500 nt。简单重复序列(SSR)和单核苷酸多态性(SNP)分析发现，SSR中双碱基重复个数最多，达到18，938个;SNP中转换变异大约占2/3。
　　3、通过对pH5.0、pH7.0-3d和pH7.0-6d表达谱文库进行两两差异表达基因分析，结果发现pH7.0-3d与酸性对照(pH5.0)相比共得到7，336个差异表达基因(DEGs)，其中显著下调的有4，669个，上调的DEGs有2，667个;在pH5.0与pH7.0-6d间，有7，973个DEGs，其中3，650个上调，4，323个下调。KEGG功能分析表明，pH5.0-Vs-pH7.0-3d、pH5.0-Vs-pH7.0-6d和pH7.0-3d-Vs-pH7.0-6d中分别有1，836、2，182和1，054个DEGs被显著富集到6、7和8条代谢途径中。在转录组文库中筛选到超过24种不同家族的转录因子，其中DEGs主要涉及ERF、NAC、WRKY、bHLH和MYB等转录因子家族。等级聚类分析三处理间的表达模式，发现486个DEGs被分成6种模式，其中最多的是上调-上调-下调表达模式。随机选取6条Unigene用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术对RNA-Seq差异表达基因的表达趋势进行验证，结果表明RPKM法和qRT-PCR法测定的DEGs表达趋势相似，两者相关系数R值达到0.8210，呈极显著水平。
　　4、蓝莓分别水培于pH5.0-NH4+、pH5.0-NO3、pH7.5-NH4+和pH7.5-NO3介质中处理15d。结果显示，在pH7.5-NH4+和pH7.5-NO3-处理下蓝莓根系发黑，Fv/Fm下降。叶绿素含量、根系活力和全氮含量在pH5.0-NH4+处理下最高，其次是pH5.0-NO3，最差的是在pH7.5-NH4+处理中。与铵态氮源处理相比，以硝态氮为氮源的植株其硝酸含量上升，并与pH相关性不大。与酸性处理相比，碱性处理下显著增加FCR活性，与不同氮源形态相关性较小。
　　5、利用qRT-PCR分析蓝莓根系氮、铁代谢相关基因的表达变化，结果发现与pH5.0-NH4+相比，转录因子（FER）和铁蛋白基因(Fer2)在其它3个处理下表达相对下降，而铁螫合还原酶（FR O2）、天然抗性相关巨噬细胞蛋白3（Nramp3）和H+-ATPsae酶（HA）基因表达都上调。铵转运蛋白基因(AMTs)在有铵态氮源下显著上调表达;以硝态氮为唯一氮源时，硝酸转运蛋白（NRT1.5和NR T2）、硝酸还原酶(NR)和亚硝酸还原酶基因(NiR)被诱导表达均上调，说明这些与氮转运和还原相关的基因主要受不同氮源形态影响。氨同化过程中的谷氨酰胺合成酶(GSs)和谷氨酸合成酶基因（GOGA Ts）在高pH胁迫下表达下降，并与氮源形态相关性不显著，表明氨同化相关基因主要受pH影响。

目录

摘要

第一部分 文献综述

1 不同pH值对蓝莓影响的研究现状

1．1 不同pH值对蓝莓生长的影响

1．2 不同pH值对蓝莓矿质元素的影响

2 植物铁营养代谢

2．1 植物铁吸收机制

2．2 植物铁营养代谢的相关基因

3 植物氮营养代谢

3．1 植物对氮素吸收同化的过程

3．2 植物氮营养代谢的相关基因

4 转录组概述

5 高通量测序技术的介绍

6 RNA-Seq(转录组测序)技术的研究应用

7 本研究的目的及意义

第二部分 研究论文

第一章 浙江主栽的5个蓝莓品种对不同pH根际土壤处理的适应性

1 引言

2 材料与方法

3 结果与分析

4 讨论

第二章 不同pH处理下蓝莓根系转录组分析

1 引言

2 材料与方法

3 结果与分析

4 讨论

第三章 不同pH处理下蓝莓根系数字基因表达谱分析

1 引言

2 材料与方法

3 结果与分析

4 讨论

第四章 不同pH和不同氮源处理对蓝莓生理及氮、铁代谢相关基因表达水平的影响

1 引言

2 材料与方法

3 结果与分析

4 讨论

第五章 结论与展望

1 研究结论

2 研究展望

参考文献

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

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