水稻质体发育调控基因(OsFLN2)的克隆及初步功能分析

摘要

叶绿体是绿色植物进行光合作用的重要场所，同时也是光合色素的载体，广泛分布在叶片绿色组织细胞中。高等植物叶绿体的发育是一个非常复杂的调控过程，需要核基因编码蛋白和叶绿体基因编码蛋白协调完成，叶色突变是研究质体、叶绿体发育的重要材料，相关调控机制的研究结果在基础研究和生产实践中都将发挥非常重要的作用。水稻白穗突变体ap(t)1是由粳稻品种“日本晴”经EMS诱变而来，该突变体在3叶期之前表现为完全的白化，随着植株的生长，3叶期之后新抽出的叶片开始转绿，而老叶片的叶绿体发育也缓慢恢复，呈现白色条纹状，抽穗期穗部白化。图位克隆发现位于第3号染色上的AP(t)1基因（LOC_Os03g405500）第五个外显子出现一个单碱基的替换突变，由G突变为A，引起第537个氨基酸由色氨酸（Trp）突变为终止密码子，导致蛋白编码提前终止。将互补载体转化突变体后，突变表型得以恢复正常，进一步证实AP(t)1基因突变确实是造成水稻白化的内在原因。生物信息学分析结果表明AP(t)1与拟南芥AtFLN2基因同源。Real-time PCR实验表明，OsFLN2基因在水稻中各个部位都有表达，但主要在叶片中表达。Ap(t)1突变体中OsFLN2基因的表达量显著下降，而互补转基因株中的表达量与野生型基本一致。OsFN2基因突变后对质体编码的RNA聚合酶(PEP)参与编码的基因影响较大，突变体中的PEP类基因的表达量较野生型显著下降，而核编码的RNA聚合酶(NEP)类基因变化不大。亚细胞定位实验发现OsFLN2定位于水稻原生质体的叶绿体上。运用CRISPR-Cas9技术根据目的基因的序列对野生型进行定点敲除，产生的纯合型敲除阳性转基因株表型与突变体类似，而且定点突变后的白化转基因株后期并不能转绿，说明定点突变株中OsFLN2的功能可能遭到了更为严重的破坏。对FLN2功能的解读，将为进一步揭示质体及叶绿体发育机制，阐明植物光合复合体的分子作用机理奠定基础。

目录

摘要

1 文献综述

1．1 水稻叶色突变体的类型

1．2 水稻突变体的来源

1．2．1 物理和化学诱变

1．2．2 插入突变

1．3 叶绿体的结构及发育

1．3．1 叶绿体的结构

1．3．2 叶绿体的发育

1．4 叶绿素的合成与降解

1．5 叶色相关基因的研究进展

1．5．1 叶绿素合成与降解相关基因

1．5．2 叶绿体发育相关基因

1．5．3 其他色素代谢相关基因

1．6 质体发育相关基因研究进展

1．7 本研究的目的和意义

2 试验材料与方法

2．1 研究材料

2．1．1 植物实验材料

2．1．2 实验菌株和载体材料

2．2 常用试剂与仪器

2．2．1 化学试剂

2．2．2 主要实验仪器

2．3 实验方法

2．3．1 水稻DNA提取和RNA提取及反转录

2．3．2 PCR扩增体系和PCR扩增目的片段回收

2．3．3 实验相关载体构建

2．3．4 大肠杆菌的质粒提取

2．3．5 大肠杆菌及农杆菌感受态的制备

2．3．6 大肠杆菌和农杆菌转化

2．3．7 农杆菌介导的水稻基因转化

2．3．8 水稻原生质体制备及转化

2．3．9 CRISPR-Cas9的方法构建FLN2定点突变转基因植株

3 实验结果与分析

3．1 突变体的表型分析

3．2 OsFLN2基因的图位克隆

3．3 互补验证

3．4 OsFLN2基因的表达分析

3．5 OsFLN2基因的亚细胞定位

3．6 定点突变转基因植株表型分析

4 结论与讨论

4．1 结论

4．2 讨论

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间取得的研究成果

声明