菲牛蛭多肽成分的分离纯化及性质研究

摘要

本实验采用菲牛蛭作原材料，对其含有的抗凝血物质进行分离纯化，得到抗凝血活性多肽。 首先对菲牛蛭粉末的基本成分进行测定，包括水分、灰分、蛋白和脂肪的含量。测定结果表明:菲牛蛭为一种高蛋白原料，蛋白含量可达68.1±0.10％，其它成分含量均较低。采用pH沉淀法、丙酮提取法、水提醇沉法、碱性蛋白酶酶解法、硫酸铵沉淀法五种方法对菲牛蛭蛋白进行粗提。碱性蛋白酶提取得到的菲牛蛭多肽的抗凝血活性最高，为35.47±0.55U/g。 为优化碱性蛋白酶提取工艺，研究了加酶量(U/g)、时间(min)、料液比和pH对碱性蛋白酶提取效果的作用，通过正交实验确定最佳工艺条件为:加酶量为2000U/g，酶解时间为250min，料液比为1∶15，pH为9，可得抗凝血活性为72.3U/g，水解度为31.6％。 得到高抗凝血物质的同时，另对抗凝血物质进行了抗氧化活性的测定，包括羟基自由基的清除、还原能力的测定、超氧阴离子的清除。测定结果表明:菲牛蛭酶解的抗凝血活性多肽表现出来一定的羟基自由基清除能力、一定的还原力和明显的超氧阴离子清除能力。 为了进一步对提取物质进行分离纯化，本实验使用阴离子交换层析DEAE Sephadex A-50和凝胶过滤层析Sephadex G-50进行分离。DEAE Sephadex A-50得到三个组分的干燥产品，结果表明主峰HA为活性峰，活性为202.5±2.15U/g。用Sephadex G-50凝胶过滤层析进行进一步纯化，得到具有更高活性的HA2(358.96±1.56U/g)。收集洗脱峰，进行冷冻干燥。 对得到的抗凝物质进行性质的分析，通过紫外光谱扫描得出，提取液在295nm处有最大吸收峰。傅里叶红外光谱分析得出了菲牛蛭多肽在500-4000cm-1范围内酰胺A、酰胺B、酰胺Ⅰ、酰胺Ⅱ的红外图谱。对抗凝血活性多肽的含量进行测定结果表明，在抗凝血活性为358.96U/mL时，多肽浓度为0.7781mg/mL，最终得出所纯化的多肽抗凝血比活为461.33U/mL。基质辅助激光解析飞行时间串联质谱得出活性物质为一种寡肽。 对抗凝血物质的稳定性进行了测定分析表明，此抗凝血活性物质适合在中性或者弱酸性条件下，在高温下极易变性失活，应保存在低温环境中。

目录

声明

摘要

1前言

1．1水蛭简介

1．1．1水蛭的生长习性与地域分布

1．1．2水蛭的化学成分分析

1．1．3水蛭的药理作用

1．1．4临床应用

1．2菲牛蛭简介

1．2．1菲牛蛭的化学成分

1．2．2菲牛蛭的药理作用

1．2．3菲牛蛭的研究利用现状

1．3抗氧化蛋白、多肽的研究

1．3．1抗氧化的研究现状

1．3．2抗氧化机理

1．3．3抗氧化活性的评价方法

1．4．1蛋白多肽的纯化技术

1．4．2菲牛蛭抗凝物质的分离纯化进展

1．5．1本课题的研究背景意义

1．5．2主要研究内容

2材料与方法

2．1．1原辅料

2．1．2主要试剂

2．1．3主要仪器与设备

2．2实验方法

2．2．1菲牛蛭基本成分的测定

2．2．2菲牛蛭的不同粗提取方法

2．2．3碱性蛋白酶提取菲牛蛭多肽的单因素正交实验

2．2．4抗凝血活性多肽的抗氧化测定

2．2．5抗凝血活性多肽的纯化

2．2．6抗凝血活性多肽性质的研究

3结果与讨论

3．1不同粗提取方法菲牛蛭多肽的活性

3．1．1菲牛蛭基本成分的测定

3．1．2碱性蛋白酶活性测定

3．1．3粗提取菲牛蛭活性物质

3．2碱性蛋白酶催化菲牛蛭多肽的酶解工艺研究

3．2．1碱性蛋白酶酶解菲牛蛭多肽的单因素实验

3．3碱性蛋白酶提取菲牛蛭多肽的正交试验

3．3．1工艺验证实验

3．4碱性蛋白酶酶解菲牛蛭多肽的抗氧化评价

3．4．1羟自由基的清除

3．4．2还原能力的测定

3．4．3超氧阴离子的清除

3．5抗凝血活性多肽的纯化

3．5．2凝胶过滤层析——Sephadex G-50

3．6抗凝血活性多肽的结构特性研究

3．6．1紫外光谱

3．6．2傅里叶红外光谱

3．6．3抗凝血活性多肽含量测定-Lowry法

3．6．4 MALDI-TOF-MS鉴定

3．6．5稳定性实验

4结论

4．1全文总结

4．2论文的创新点

4．3论文的不足之处

5 展望

参考文献

7攻读硕士学位期间论文发表情况

致谢