高产异养型微拟球藻培养工艺的研发及反应动力学的研究

摘要

微藻又称单细胞藻类，是广泛存在于海洋和陆地上的一类低等的、可利用光合作用的藻类微生物总称。因其富含优质的脂肪酸和蛋白质等营养成分，近年来被广泛用作DHA、EPA，饲料添加剂及生物柴油等产品的生产原料。特别是作为饲料添加剂，市场需求量日益增大，国内外已商品化微藻蛋白生产商(如墨西哥的Texcoco)年产量均已达百吨级，产值过亿，仅台湾省的海藻饲料年产量就达120吨。但中国微藻饲料蛋白的供求仍存在较大缺口，由于微藻的天然营养方式为光能自养型，传统的光照培养因其占地大、周期长等因素导致产能较低，远不能满足市场需求，因此更多研究转向筛选及选育兼性或化能异养型的菌株，并通过控制培养条件优化培养方式来实现高密培养、降低成本及扩大产能。
　　本文以微拟球藻作为生产菌株，在代谢调控发酵以及动力学相关理论的指导下，对微拟球藻发酵过程中的形态特征、条件优化以及动力学模型做了详尽研究，主要内容及结果如下:
　　(1)培养条件对微拟球藻菌体形态以及胞内蛋白含量的影响。通过对微拟球藻形态学观察研究显示:微拟球藻具有胶质囊泡及游离的单细胞两种不同的生活形态，并且在发酵过程中由胶质囊泡逐渐向单细胞转换。发酵过程中前20h，处于分批发酵过程中的延滞期及对数期，菌体一般是胶质囊泡形态占优势，细胞尺寸逐渐增大;20h-28h，减速期过程中胶质囊泡与游离的单细胞共存;28h以后，随着发酵的进行，在稳定期及衰亡期，由单细胞占绝对优势。此外，温度、pH及剪切力等培养条件的研究表明，培养条件对胶质囊泡全部转化为单细胞的时间以及胞内蛋白含量有较大影响，并且剪切力对菌体形态有较大影响。
　　(2)响应面法对微拟球藻产微藻蛋白的发酵条件优化。通过单因素试验及响应面设计分析温度、pH、搅拌速度及通气量对微拟球藻产微藻蛋白浓度的影响，得到最佳发酵条件的回归模型，经方差分析证明该模型高度显著(P＜0.001)，修正复合系数R2Adj达0.7889，失拟项不显著，表明回归方程能准确预测微藻蛋白浓度随各因素变化的规律。优化后获得最佳发酵工艺为:温度30℃、pH6.9、搅拌速度340r/min、通气量0.65vvm，在此条件下得到微藻蛋白浓度为6.18g/L，较优化前提高了9.18％，微藻生物量达11.24g/L，与王芝瑶等研究相比提高了70.3％。
　　(3)双幂指数型增长阻滞微藻发酵反应动力学模型。在发酵条件优化的基础上进行微拟球藻分批发酵的动力学研究，通过对得率系数与细胞生长速率变化规律的研究，构建了YX/S动态化模型方程及双幂指数型增长阻滞菌体生长模型。利用matlab对模型进行非线性拟合，获得模型参数，模型拟合值与实验测定值基本相符，表明新建模型能较好地描述微拟球藻发酵过程中的菌体生长、蛋白合成及葡萄糖消耗的动力学特征，可实现一定规模的微拟球藻发酵过程的预测及控制。此外β近似于0，表明微藻蛋白合成属于生长偶联型，进一步进行50L发酵罐放大实验，结果显示模型具有较好的适用性，验证了模型用于发酵过程预测的可靠性。
　　(4)微拟球藻分批补料发酵反应动力学研究。采用恒速流加的方式进行补料，并建立了微拟球藻分批补料发酵过程中的菌体生长、底物消耗及产物合成的动力学模型，根据已知模型参数进行非线性拟合，结果显示实测值与拟合值基本相符，相关系数均大于0.95，表明模型能够较好地反映微拟球藻的分批补料发酵过程。

目录

摘要

第一章 文献综述

1．1 微拟球藻概述

1．2 微藻国内外的研究进展

1．3 微藻的综合应用

2 微藻蛋白概述

2．1 微藻蛋白的氨基酸组成

2．2 微藻蛋白的生物学活性

2．3 微藻蛋白的开发及应用

3 微藻的培养工艺

3．1 微藻的营养方式

3．2 微藻的培养策略

4 发酵过程中动力学模型的构建

5 论文的研究思路及目标

第二章 培养条件对微拟球藻菌体形态以及胞内蛋白含量的影响

1 前言

2 材料与方法

2．1 材料

2．2 实验方法

3 结果与讨论

3．1 微拟球藻发酵过程中菌体形态的变化

3．2 培养条件对菌体形态及蛋白质含量的影响

4 小结

第三章 响应面法对微拟球藻产微藻蛋白的发酵条件优化

1 前言

2 材料与方法

2．1 材料

2．2 方法

2．3 发酵条件优化

3 结果与分析

3．1 单因素试验

3．2 Box-Benhnken试验设计及结果

4 小结

第四章 双幂指数型增长阻滞微藻发酵反应动力学模型

1 前言

2 材料与方法

2．1 材料

2．2 方法

2．3 数据测定和模型参数求解

3 结果与分析

3．1 Monod模型对分批发酵过程的拟合

3．2 YX／S动态模型的构建

3．3 双幂指数型增长阻滞模型对分批发酵过程的拟合

3．4 50 L发酵罐放大实验及动力学模型的验证

4 小结

第五章 微藻分批补料发酵反应动力学研究

2．1 材料

2．2 方法

3 结果与讨论

3．1 微拟球藻分批补料发酵过程曲线分析

3．2 分批补料发酵动力学研究

3．3 分批补料发酵的优化研究

4 小结

第六章 结论与建议

1 结论

2 建议

参考文献

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

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