γ-内脏平滑肌型actin基因的可变剪接对湖羊肌肉发育和肉质性状的调控作用

摘要

湖羊是中国特有的羔皮用绵羊品种，具有性成熟早，繁殖率强，肉质细嫩的优点。但与杜泊羊等专门化肉羊品种相比，湖羊的肉用性能和屠宰率较低。本论文针对雄性初生及六月龄湖羊与杜泊羊×湖羊杂交F1代羊的肌纤维特性、MYL3与ACTG2基因的可变剪接在不同肌肉组织的表达情况进行研究，探究湖羊骨骼肌生长发育的分子机理，探寻MYL3和ACTG2基因与肌纤维生长和脂肪积累的关系，这些结果可为湖羊产肉性状的分子改良提供新的思路，也为肉用湖羊新品系的选育奠定理论基础。
　　本试验屠宰了12头雄性初生及六月龄纯种湖羊和杜泊×湖羊杂交F1代羊（刚出生、6月龄各半），采集了BFM、LDM、MGM、GM、VLM、SOL和SSC7种肌肉组织，(1)利用石蜡切片、HE染色测定了不同肌肉组织的肌纤维直径和长度，利用油红O染色显示肌肉样品的脂肪分布;(2)分析了雄性纯种湖羊、杜泊×湖羊杂交羊7种肌肉组织内MYL3、ACTG2及其5'UTR可变剪接的表达情况;(3)构建ACTG25'UTR不同剪接方式的双荧光素酶报告基因，转染猪肾细胞(PK-15)和鸡成纤维细胞(DF-1)，测定了荧光素酶活性和ACTG25'UTR不同剪接方式的表达情况。研究结果如下:
　　(1)除雄性湖羊SOL肌纤维直径和长度在初生羊和6月龄羊间不存在显著差异外，雄性湖羊和杜泊×湖羊杂交F1代羊初生羊的BF、LDM、MGM、GM、VLM和SSC肌纤维直径和长度均显著或极显著小于6月龄羊(P＜0.05或P＜0.01);雄性湖羊初生羊、6月龄羊的LDM样品肌纤维直径均小于同月龄的杜泊×湖羊杂交F1代羊(P＜0.05);雄性6月龄纯种湖羊BFM(P＜0.05)、LDM(P＜0.01)肌纤维长度显著或极显著小于同月龄杜泊×湖羊杂交羊。雄性纯种湖羊及杜泊×湖羊杂交羊初生羊BFM的脂肪含量显著低于同品种的6月龄羊（P＜0.05），SOL中脂肪含量极显著低于同品种6月龄羊(P＜0.01)。雄性纯种湖羊初生羊VLM、SSC肌肉组织中脂肪含量显著低于同品种6月龄羊(P＜0.05)。
　　(2)构建了ACTG25'UTR不同剪接序列(65bp、83bp、116bp)的双荧光素酶报告基因pLUC-65、pLUC-83、pLUC-116载体，猪肾细胞(PK-15)和鸡成纤维细胞(DF-1)转染结果显示，pLUC-83和pLUC-116启动子活性最强，可显著提高ACTG283bp的5'UTR序列的载体的表达量(P＜0.05)。
　　(3)初生纯种湖羊SOL中MYL3的表达量极显著高于LDM、SSC(P＜0.01)，显著高于MGM中的表达量(P＜0.05);BFM中MYL3的表达量显著高于LDM、SSC(P＜0.05);SOL中ACTG2基因5'UTR长度为83bp的剪接表达量显著高于LDM(P＜0.05);SSC中该种剪接形式在总的ACTG2基因表达量所占的比例显著高于BFM、GM、VLM、SOL(P＜0.05)。6月龄纯种湖羊BFM中MYL3基因的表达量极显著高于其他6种组织(P＜0.01)，LDM中MYL3的表达量显著高于SSC(P＜0.05);BFM、MGM中ACTG2基因的表达量显著高于其它5种组织（P＜0.05）;VLM中ACTG25'UTR长度为83bp的剪接的表达量显著高于LD、MGM、SSC样品(P＜0.05);初生杜泊×湖羊杂交羊LDM中ACTG25'UTR长度为83bp的剪接的表达量极显著高于BFM、MGM(P＜0.01)，显著高于GM、VLM、SOL(P＜0.05);6月龄杜泊×湖羊杂交羊BFM中MYL3基因的表达量显著高于LDM、VLM、SSC(P＜0.05);MGM中ACTG2基因的表达量极显著高于BFM(P＜0.01)，显著高于GM、VLM、SSC(P＜0.05);SOL中ACTG25'UTR长度为83bp的剪接形式的表达量极显著高于其它6种组织(P＜0.01)，且在LDM中表达量显著高于MGM、GM、VLM(P＜0.05)。
　　MYL3、ACTG2基因及ACTG25'UTR长度为83bp的剪接形式对湖羊的肌肉生长发育及肉质都有一定的影响。

目录

摘要

英文缩写说明

第一章 前言

1．1 骨骼肌的形成及发育

1．2 骨骼肌纤维与肌肉发育及肉质品质的关系

1．2．1 骨骼肌纤维的形成

1．2．2 肌纤维的类型

1．2．3 肌纤维与肌肉发育的关系

1．2．4 肌纤维与肉质的关系

1．3 肌动蛋白与肌肉发育及肉质品质的关系

1．3．1 肌动蛋白的构成

1．3．2 肌动蛋白的类型

1．3．3 肌动蛋白与肌肉发育的关系

1．3．4 肌动蛋白与肉质品质的关系

1．4 研究的目的与意义

第二章 雄性纯种湖羊、杜泊×湖羊杂交羊肌纤维特性研究

2．1 试验样品

2．2 试验器材及试剂

2．2．1 试验器材

2．2．2 主要试验试剂

2．3 试验方法

2．3．1 石蜡包埋切片HE染色

2．3．2 冰冻切片油红O染色

2．3．3 数据统计

2．4 结果与分析

2．4．1 HE染色结果

2．4．2 油红O染色结果

2．5 讨论

2．5．1 湖羊及杜泊×湖羊杂交F1代羊的体型外貌差异

2．5．2 肌纤维特性与体重和肉质

2．5．3 肌纤维特性、肌肉脂肪与肉质

2．5．4 肌肉脂肪与体重和肉质

第三章 湖羊、杜泊×湖羊肌肉组织中MYL3、ACTG2基因及其5'UTR可变剪接的表达与分析

3．1 试验样品

3．2 主要仪器与试剂

3．2．1 主要仪器设备

3．2．2 主要试剂

3．2．3 常用相关试剂配制

3．3 试验方法

3．3．1 试验样品总RNA的提取及质检

3．3．2 实时荧光定量PCR验证基因表达差异

3．3．3 MYL3基因、ACTG2基因在健康组织中的表达谱及信号通路分析

3．4 结果与分析

3．4．1 雄性湖羊、雄性杜泊×湖羊杂交羊不同肌肉组织MYL3基因表达分析

3．4．2 雄性湖羊、雄性杜泊×湖羊杂交羊不同肌肉组织ACTG2基因及其可变剪接表达分析

3．5 讨论

3．5．1 实时荧光定量PCR的选择

3．5．2 信号通路中差异表达基因的定量及影响肌肉发育与肉质的因素

第四章 湖羊ACTG2基因5'UTR区UTR不同剪接双荧光素酶报告基因的构建及细胞特异性验证

4．1 试验样品与设备

4．1．1 试验样品

4．1．2 主要的试验试剂

4．1．3 主要仪器与设备

4．2 试验方法

4．2．2 ACTG2 5'UTR不同剪接序列克隆及鉴定

4．2．3 ACTG2 5'UTR不同序列启动子活性分析及细胞特异性验证

4．2．4 荧光定量PCR验证

4．3 结果与分析

4．3．1 双荧光素酶报告基因检测活性

4．3．2 荧光定量PCR验证结果

4．4 讨论

第五章 结论

创新点

展望

参考文献

致谢

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