拟南芥水杨酸代谢突变体的筛选克隆和S5H同源基因的功能分析

摘要

在植物中，水杨酸(SA)作为一种重要的内源激素调控植物的抗病、抗逆、生长发育和衰老。其代谢机理是SA研究的重要内容之一。在拟南芥中，SA合成和分解代谢路径尚未被阐述清楚。为了深入揭示水杨酸代谢的分子机制及生理功能，本文利用EMS诱变因SA积累而变小的拟南芥双突变体s3h*s5h，筛选表型恢复变大的突变体，用正向遗传学方法克隆SA代谢相关基因。同时通过生物信息学、分子生物学、生物化学、遗传学等研究方法研究一个水杨酸羟基化代谢候选基因At4g10490(DLO2)的生理学功能。取得的具体研究结果如下:
　　(1)本文利用一种依赖于水杨酸突变体表型筛选水杨酸相关突变体的方法，对EMS诱变的水杨酸积累的拟南芥双突变体Col-0 s3h*s5h进行筛选，筛选出表型恢复变大的突变体，建立表型恢复突变体库。对已筛选出的突变体进行表型、直径及水杨酸代谢水平进行统计。本文已筛选出20个与水杨酸代谢及叶片衰老相关的突变体，并根据其表型及水杨酸代谢水平分为四类，分别为:Ⅰ表型恢复变大且叶片晚衰，SA含量降低的突变体;Ⅱ表型恢复变大且叶片晚衰，SA含量与双突变体s3h*s5h相似的突变体;Ⅲ表型恢复变大且叶片早衰，SA含量与双突变体s3h*s5h相似的突变体;Ⅳ表型变小且叶片晚衰，SA含量降低的突变体。
　　(2)将突变体与水杨酸积累的拟南芥双突变体Col-0 s3h*s5h进行回交，收获F1代种子后播种，待植株成熟后收获F2代种子并继续播种，获得F2代植株后其表型分离比符合3∶1。并挑选大的F2代植株提取DNA送去公司进行重测序，本文已经对两株突变体进行了重测序。
　　(3)本文利用CRISPR/Cas9技术创建Ws生态型的双突变体s3h*s5h。将s3h*s5h/Ws与突变体进行杂交，待F1代植株成熟后收获F2代种子并继续播种，获得F2代植株后其表型分离比符合3∶1。并挑选大的F2代植株提取DNA进行图位克隆，利用不同生态型之间单核苷酸序列的多样性确定基因位置。
　　(4)本文利用杂交技术将表型相似的6种突变体进行两两杂交获得F1代植株并对其表型进行观察，随机抽取F1代植株进行水杨酸代谢分析，检测不同突变体之间突变基因的异同。已证明其中5个突变体108008、109004、113016、116003、24-3之间的突变基因不同。
　　(5)本文利用生物信息学手段和公共数据库基因芯片结果对所预测的基因表达模式进行分析，初步获得和水杨酸羟基化代谢有潜在关联的候选基因At4g10490(DLO2)，该基因与羟基化基因S3H亲缘关系相近。
　　(6)体外诱导表达纯化候选基因的蛋白后，以水杨酸为底物，利用酶活测定方法和高效液相色谱仪测定酶反应产物，结果表明DLO2基因编码的蛋白可以在体外催化水杨酸羟基化为2，5-DHBA。
　　(7)利用CRISPR/Cas9技术、农杆菌介导的拟南芥转基因方法、PCR技术和酶切的方法获得了突变体s3h*s5h*dlo2和s5h*dlo2并对其叶片表型和代谢进行分析。本研究可知在突变体s3h*s5h及s5h中敲除DLO2基因，其叶片表型和代谢并没发生明显改变，表明DLO2基因在叶片衰老中的功能并不明显。
　　(8)利用拟南芥转基因技术，成功将pMDC32-DLO2载体转入水杨酸积累的拟南芥双突变体s3h*s5h，获得互补型植株后对其叶片表型及代谢进行分析，结果显示其表型变大但并未恢复WT水平，而其水杨酸代谢水平已恢复至WT代谢水平。证明DLO2在拟南芥中确实有将水杨酸羟基化的功能，并具有生理功能。以上结果表明，利用EMS诱变技术诱变水杨酸积累的拟南芥双突变体s3h*s5h可获得与水杨酸代谢及衰老相关的突变体;At4g10490基因编码的蛋白可催化SA羟基化生成2，5-DHBA，在植物体内具有生理功能。

目录

摘要

第一章 文献综述

1 水杨酸生物学功能

1．1 SA与植物抗病反应

1．2 SA与植物衰老

1．3 SA与植物抗环境胁迫

1．4 其他功能

2 水杨酸的合成代谢研究

2．1 ICS路径

2．2 PAL路径

3 水杨酸的分解代谢研究

3．1 糖基化

3．2 甲基化

3．3 羟基化

3．4 氨基酸化

3．5 磺化反应

4 水杨酸代谢的调控

5 突变体筛选方法

6 研究的目的意义

第二章 水杨酸代谢突变体的筛选及克隆

1 材料与方法

1．1 供试材料

1．2 供试菌株、载体和酶

1．3 拟南芥的种植

1．4 EMS诱变及筛选

1．5 Ws s3h*s5h 双突变体的创制

1．6 拟南芥材料的杂交和回交

1．7 水杨酸代谢突变体的重测序和基因定位

1．8 水杨酸含量的测定

2．结果与分析

2．1 SID2和NPR1可以互补双突变体衰老表型

2．2 水杨酸代谢相关突变体的筛选

2．2 Ws s3h*s5h的突变体的创制和表型、代谢分析

2．3 水杨酸代谢突变体的重测序和基因定位

3．讨论

第三章 拟南芥S5H同源基因DLO2的功能分析

1．材料与方法

1．1 试验材料

1．2 供试菌株、载体和酶

1．3 DLO2体外酶活测定

1．4 DLO2突变体的鉴定和表型、代谢分析

1．5 DLO2超表达植株创制和表型、代谢分析

2．结果与分析

2．1 系统进化树的构建

2．2 酶的生化活性

2．3 CRISPR Cas9技术创制突变体表型及代谢分析

2．4 拟南芥中超表达转基因植物的表型和代谢分析

3．讨论

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的学术论文

致谢

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