脂肪酶基因的克隆表达以及枯草芽孢杆菌基因组的改造

摘要

枯草芽孢杆菌Bacillu.subtilis是一个被广泛应用的外源基因表达的菌株，并且该表达系统能和发酵技术联系起来，广泛用于工业酶的生产，因此Bacillussubtilis作为表达菌株受到越来越多的关注。目前，对其研究越来越深入，葡萄球菌属Staphylococcus的质粒pUB110能在Bacillu.subtilis中生存，并以这些质粒为基础改造出很多克隆质粒和表达质粒；其全基因组序列已经明确，可以根据外源基因表达需要改造基因组背景；Bacillu.subtilis为非致病性菌株，不含内毒素，是公认的安全菌株(Generall.Recognize.A.Safe)。很多外源基因已经成功在Bacillu.subtilis表达系统中得到高表达，Bacillu.subtilis也必将成为外源基因最具潜力的表达宿主菌之一。
　　 Bacillu.subtilis有多种蛋白质分泌途径，但外源基因的分泌一般采取SRP-Sec途径，这是由一组膜蛋白SecE、SecG、SecY形成的极性跨膜通道来完成的。SRP-Sec途径要求分泌蛋白前体在转移之前不能折叠，通过细胞膜上的极性通道将蛋白前体转移到细胞膜外。该通道在细菌、古细菌和真核生物中的结构比较保守，大肠杆菌E.coli的SRP-Sec分泌途径涉及到SecA、SecB、SecD、SecE、SecF、SecG、SecY、YajC等固有的膜整合蛋白。Baciilu.subtili.SecA与E.col.SecA有87％相似性. SecE、SecG、SecY在Bacillu.subtilis中有同源物且功能相似。在分泌过程中，核糖体首先合成带有信号肽的分泌蛋白前体，前体与信号肽识别颗粒SRP识别结合，形成的二元复合物与SecA亲和性很强，该复合体通过极性跨膜通道转移到膜外。此过程中分子伴侣起辅助作用，避免蛋白聚集，保持蛋白前体的转运能力。研究表明，高表达组成转运复合体的转移酶，能促进外源蛋白的分泌，使外源蛋白的表达量大大增加。
　　 本论文主要有两部分内容：
　　 第一，在枯草芽孢杆菌中表达地衣芽孢杆菌Bacillu.licheniformis胞外脂肪酶基因bli02525。构建重组表达质粒，转化枯草芽孢杆菌结果得到很高的蛋白质表达量，测定培养基上清酶总活力达到76 units/mL。并测定了酶的最适反应温度、最适pH、温度稳定性、pH稳定性等性质及其他生化性质，进一步了解了该酶的生物性质，为工业化应用提供理论数据，值得关注的是酶在pH10-10.5条件下活力最大，碱性条件下(直到pH12)仍然保持很好的稳定性。
　　 第二，针对跨膜转运涉及到的关键蛋白质SecA、SecE、SecG、SecY，对其基因进行亚克隆，增加一段强启动子，并整合到Bacillu.subtilis-168菌株的基因组中，得到稳定并高表达SecA、SecE、SecG、SecY的枯草芽孢杆菌菌株，以提高蛋白质跨膜转运效率从而提高外源蛋白的产量。从Bacillu.subtilis-168基因组扩增secA、secE、secG、secY基因并增加强启动子后克隆到一个同源整合载体上，得到阳性质粒转化感受态Bacillu.subtilis，通过单交换的方式把基因整合到基因组上，得到优化菌株B.sub.EGYA：cm。该菌株使蛋白质分泌途径SRP-Sec途径的转运通道相关蛋白过表达，从而增加了蛋白质跨膜转运效率，有利于外源蛋白更高效地分泌到细胞外。这将是在枯草芽孢杆菌分泌表达系统改进上的一个很大飞跃，对提高蛋白质表达量有主要意义。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略表

声明

第一章 绪论

1 关于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis的背景及研究现状

1.1 Bacillus subtilis是有良好应用前景的表达菌株

1.2.Bacillus subtilis作为外源基因表达系统的研究现状

2 胞外脂肪酶的背景及研究现状

2.1 脂肪酶的背景及应用

2.2 胞外脂肪酶的研究现状

3.本文研究的内容

3.1 研究基础

3.2 研究内容

3.3 研究目的及意义

第二章 胞外脂肪酶基因的克隆及其在枯草芽孢杆菌中的表达

1.引言

2.材料、试剂和方法

2.1 材料试剂

2.2 基因克隆

2.3 表达载体的构建

2.4 胞外脂肪酶基因的表达及酶活力分析

2.5 脂肪酶的性质分析

3 结果与讨论

3.1 表达载体构建

3.3 胞外脂肪酶的表达及酶活力分析

3.4 脂肪酶的性质分析

4 小结

第三章 从蛋白质分泌的主要途径SRP-Sec途径方面改造Bacillus subtilis基因组

1 引言

2 材料、试剂和方法

2.1 材料试剂

2.2 源重组载体的构建

2.3 同源重组载体整合枯草芽抱杆菌基因组

3. 结果

3.1 同源重组载体的构建

3.2 同源重组载体与枯草芽抱杆菌基因组的同源重组

4 小结

第四章 结论

参考文献

致谢

附录

研究成果