Riboswitch cDNA体外组装及相关文库构建

摘要

Riboswitch称为核糖开关,广泛存在于各种生物体内,可以认为是一类对小分子代谢物敏感的结构RNA,通过结合小分子代谢物在转录与翻译水平调控基因表达。它们通常位于mRNA的5'-非翻译区(5'-untranslated regions UTR),不编码蛋白质,可以不依赖任何蛋白因子而直接结合小分子代谢物,继而发生构象重排,影响该mRNA的活动,调控小分子代谢物相关蛋白的表达。特异性与之结合的小分子代谢物一般为赖氨酸(Lysine),黄素单核苷酸(flavin mononucleotide,FMN),硫胺素焦磷酸(Thiamine pyrophosphate,TPP),甘氨酸(glycine),维生素B12氰钴铵(Cobalamin)等,其中与小分子结合的区域称为适配体结构域(aptamer domain,AD)。
　　 合成生物学的发展使得基因的人工合成变为可能。由于利用传统的碱基按序合成的方法来合成各种预期目的基因或者基因组序列既浪费时间又浪费资金,并且合成的目标序列有着很高的出错率,同时在多元平行构建基因的过程中,需要大量合成短的寡核苷酸(oligos)。随着科技的发展,微流体芯片技术的应用可以使我们平行合成寡核苷酸的过程变的相对简单与高效。由此可使得人工合成基因的过程简化为连接组装寡核苷酸片段。
　　 本论文以可程序控制的微流体PicoArray芯片平行合成的多元Riboswitch寡核苷酸(这些多元寡核苷酸经过人为设计和改良)为材料,通过扩增回收纯化,混合成为寡核苷酸混合物(OligoMix),酶切纯化,连接与组装,PCR扩增,电泳检测等过程组装全长的Riboswitch基因。通过对合成目的基因与载体的连接,转化,克隆,提取质粒,进而对体外组装结果进行验证。通过质粒抽提,PCR,目的片段的回收纯化与检测,含量检测,获取Riboswitch目的基因的相关数据。将Riboswitch文库中DNA分子所对应的RNA序列进行M-fold二级结构折叠预测。通过文献查阅,按照配体的不同对Riboswitch分类,进而给出与配体结合的Riboswitch分子的保守区域与保守区域的二级结构折叠图像。依据配体的不同,结合Riboswitch DNA相关数据与二级结构折叠预测和适体保守区域分析,构建相应的Riboswitch文库,为后续的Riboswitch结构与功能研究奠定基础。