芯片探针杂交效率的影响因素分析

摘要

芯片技术是近年发展起来的高通量筛选技术,已应用于生命科学研究的诸多领域,特别是在基因组再测序、基因多态性的信息检测和基因表达检测等方面得到快速发展和应用。芯片技术操作流程探针设计、芯片制备、样本纯化标记、芯片杂交、信号检测和芯片数据分析。探针设计是芯片实验过程的关键环节,其质量的优劣将直接影响最终的芯片实验结果。探针的筛选主要是根据探针灵敏度和特异性的要求,选择一个或多个靶标序列的候选探针,使芯片上的探针能与靶标结合而与非靶标不发生结合,从而有效的完成芯片杂交过程。
　　 寡核苷酸探针可以提高靶序列特异性,改善探针与标记样本的杂交特性,并且可更好地区分来自像剪切体或同一基因家族的相似靶序列。靶序列的二级结构是一种很普遍的现象,即使在较高温度下靶序列形成的双链也能稳定存在。在很多优化探针设计的软件中,未考虑靶序列二级结构对杂交的影响。靶序列二级结构是干扰杂交的潜在因素,同时也是影响分析芯片结果、设计芯片标准的重要因素。在寡核苷酸探针设计的过程中引入靶序列二级结构的因素,可以改变最优探针的选择。
　　 本实验通过对加强型绿色荧光蛋白(EGFP)RNA序列进行覆瓦式探针设计,制作原位合成的微流体芯片,研究探针/靶序列杂交双链AG、Tm、靶序列二级结构和探针末端碱基因素对芯片杂交信号值的影响。结果表明,相同AG和Tm值的探针/靶序列杂交双链的杂交信号值存在较大差异,探针/靶序列杂交双链AG和Tm值对芯片杂交信号值影响没有明显的规律性;表征靶序列二级结构信息的探针PT-sc参数与芯片杂交信号值间呈较好的线性关系;探针5’末端碱基组成对芯片杂交信号值也有影响,5’末端碱基为G/C的探针杂交信号值总体上高于其邻近的5’末端碱基为A/T的探针的杂交信号值。
　　 通过Riboswitch覆瓦式探针芯片实验对考虑了靶序列二级结构的Mfold Probe和ArrayDesigner Probe进行比较,表明考虑RNA二级结构,可以明显提高探针的筛选效果。