抗菌肽Anoplin和PFR对白血病细胞增殖的作用及其作用机制的初步研究

摘要

抗菌肽是生物防御系统中产生的一类对抗外源性病原体的肽类物质，是生物体内固有的、非特异性免疫系统的重要组成部分。研究显示抗菌肽具有明显的杀伤革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的能力，其中少数的抗菌肽还具有抑制肿瘤细胞增殖的能力。Anoplin是2001年从独居黄蜂毒液中分离得到的一种仅由10个氨基酸残基组成的抗菌肽，是目前发现的自然界存在的最短的具有线性α-螺旋结构的抗菌肽，其具有明显的抗革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌生长的作用，而对人类的红血球无溶血作用。人类的乳铁蛋白是一类分子量为80kDa的铁离子结合型的糖蛋白，其N-末端包含一小段α-螺旋的11肽片段（LF11肽），该片段具有明显的抗革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌生长的活性。而“PFR肽”是根据人类乳铁蛋白LF11肽的构效关系设计合成的一种仅含有9个氨基酸残基的小分子抗菌肽。考虑到白血病是国内十大高发恶性肿瘤之一，因此，进一步研究这两种小分子抗菌肽对白血病细胞的影响具有重要意义。
　　 本研究以人慢性粒性白血病细胞株K562细胞，人急性粒性白血病细胞株HL-60细胞和小鼠红白血病细胞株MEL细胞为研究对象，以紫杉醇为阳性对照药物，采用MTT实验和显微镜观察法检测抗菌肽对白血病细胞增殖的抑制效果，采用PI染色结合倒置荧光显微观察法确定抗菌肽对白血病细胞的细胞膜通透性的影响，采用扫描电镜实验观察抗菌肽对白血病细胞的细胞膜形态的影响，采用流式细胞术检测抗茵肽对白血病细胞细胞周期分布的影响，采用Hoechst33342染色和流式细胞术检测抗菌肽是否引起白血病细胞的凋亡。
　　 MTT实验和显微观察的结果显示，抗菌肽Anoplin和PFR对小鼠正常骨髓细胞的增殖无影响，而这两种抗菌肽以及紫杉醇均能剂量和时间依赖的抑制三种白血病细胞的增殖，且三种白血病细胞对Anoplin的敏感性顺序为MEL＞K562＞HL-60，三种白血病细胞对PFR的敏感性顺序为MEL＞HL-60＞K562。而对三种白血病细胞而言，抗菌肽PFR的抑制效果明显优于Anoplin的。PI染色结果显示两种抗菌肽处理后白血病细胞膜的通透性均发生了明显变化，表现为对照组的白血病细胞未检测到荧光，而抗菌肽处理后的白血病细胞的细胞核出现了明显的红色荧光，且药物剂量越大荧光越明显。扫描电镜结果显示两种抗菌肽处理三种白血病细胞后细胞膜均发生明显变化，MEL细胞膜表面皱缩，破裂，甚至出现孔洞。HL-60细胞膜表面变得不平整，出现小孔。K562细胞膜表面破裂。以上结果均表明这两种抗菌肽有可能首先是通过破坏细胞膜的结构来起到杀伤肿瘤细胞的效果的。流式细胞术检测细胞周期分布的结果显示两种抗菌肽均能将MEL细胞的细胞周期显著地阻滞在G0/G1期。Hoechst33342荧光染色结果显示两种抗菌肽处理后细胞核均出现亮蓝色荧光，但是并未发现典型的凋亡小体。流式细胞术检测细胞凋亡结果显示两种抗菌肽处理后并没有出现典型的早期凋亡和晚期凋亡峰，与Hoechst33342荧光染色所得的结果一致。
　　 综上所述，本研究的结果显示了抗菌肽Anoplin和PFR不影响正常小鼠骨髓细胞的增殖，但能选择性的抑制白血病细胞的增殖，并且PFR的抑制效果明显优于Anoplin的。另外，这两种抗菌肽抑制白血病细胞增殖的机制有可能首先是通过破坏细胞膜的结构，使细胞膜出现穿孔，然后引起了胞内事件的参与，尤其是细胞周期的阻滞，从而起到抑制白血病细胞增殖的效果。