携带掌叶半夏凝集素基因的溶瘤腺病毒在肝癌治疗中的体内外研究

摘要

肝癌（Hepatocellularcarcinoma，HCC）是全球最常见的恶性肿瘤之一，在我国有着很高的发病率和死亡率，严重危害人类的身体健康，目前多以传统治疗手段为主，但已经出现了严重的瓶颈效应。生物治疗具有特异性强，毒副作用小，激发免疫系统，靶基因矫正的功能，在未来可能成为治疗肝癌的主导模式，具有广阔的应用前景。
　　 掌叶半夏凝集素（PinelliaPedatisectaAgglutinin，PPA）是储存于掌叶半夏块茎中的甘露糖结合植物凝集素。其糖结合活性可能为分析癌细胞表面糖基化的变化提供工具，并且也是研究肿瘤耐药性、迁移、恶化及预后等方面的有力工具。当前，植物凝集素已用于标记多种癌症细胞，并有可能成为肿瘤鉴别诊断、早期诊断的一个新的指标。
　　 在本研究课题中，我们将PPA同本实验室的癌症的靶向基因一病毒治疗平台结合起来，利用携带PPA基因的溶瘤腺病毒对多种癌细胞杀伤作用的体外研究，以及抗肝癌Bel-7404细胞裸鼠移植瘤的体内研究。体外研究表明，PPA基因表达对多种癌细胞具有杀伤作用。体内结果显示，PPA基因表达诱导巨噬细胞进入裸鼠移植瘤，并吞噬肝癌细胞。
　　 方法
　　 (1)利用Adeasy系统成功包装出重组溶瘤腺病毒ZD55-PPA。(2)MTT法检测ZD55-PPA对多种恶性肿瘤细胞株的增殖抑制作用。(3)细胞形态学观察病毒的杀伤力和安全性。(4)结晶紫实验检测细胞病变效应。(5)RT-PCR从mRNA上检测PPA外源基因的表达水平。(6)AnnexinV/PI流式细胞术检测ZD55-PPA诱导Bel-7404的凋亡情况。(7)运用裸鼠成瘤实验、HE染色、透射电镜实验研究PPA体内抗瘤机制。
　　 结果
　　 (1)成功使用Adeasy系统构建了携带PPA基因的溶瘤腺病毒。(2)细胞实验:MTT、形态学观察、结晶紫实验均证实PPA基因具有显著的抑制细胞增殖作用，RT-PCR实验说明PPA基因在mRNA水平上高表达，流式细胞术实验提示凋亡可能并不是PPA诱导细胞死亡的主要方式，可能还存在其他的方式。(3)荷瘤裸鼠动物实验显示PPA诱导细胞死亡可能是通过募集巨噬细胞引发吞噬现象的方式。
　　 结论
　　 体外实验结果表明，ZD55-PPA对恶性肿瘤具有一定的杀伤性和靶向性;体内试验结果表明，PPA基因在体内具有一定的毒性，抑癌机制可能是吞噬作用而非凋亡。本文首次证明PPA诱导细胞死亡的方式并非传统意义上的凋亡，而是通过募集巨噬细胞引发吞噬现象。