重组腺病毒Ad35-anti-PD-1表达的PD-1抗体增强CTL抗肿瘤功能的研究

摘要

细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocyte，CTL)是一类自身主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)限制性的抗原特异性的T细胞。因其具有有效靶向杀伤肿瘤细胞的特点，在肿瘤的个体化治疗中占有重要地位。免疫学家希望通过基础研究的突破来提高CTL过继细胞治疗(adoptivecelltherapy，ACT)的临床疗效。幸运的是，随着人们对肿瘤免疫抑制机制研究的不断深入，尤其是免疫检查点(checkpoint)PD-1(programmedcelldeathprotein1)和CTLA4(cytotoxicTLymphocyteAntigen4)的发现，为提高CTL的疗效提供了新思路。PD-1和CTLA4为T细胞活化的负调控蛋白，它们抑制了T细胞活性，降低了T细胞抗肿瘤功能。
　　本课题主要研究了PD-1信号阻断对CTL抗肿瘤功能的影响。首先我们构建了携带PD-1抗体基因的5/35型重组腺病毒载体Ad35-anti-PD-1。
　　然后我们将经PCR鉴定正确的4个病毒克隆感染293细胞，在不同时间点收集细胞上清，通过ELISA实验检测发现3号Ad35-anti-PD-1病毒克隆在72小时PD-1抗体的表达量最高，约600ng/mL。同时Westernbotting证实了表达的PD-1抗体包含正确的重链(约50kD)和轻链（约25kD）。
　　我们选取3号Ad35-anti-PD-1病毒克隆大量表达PD-1抗体，在72h收集细胞上清，用ProteinG亲和层析方法纯化PD-1抗体。考马斯亮蓝染色证实了纯化出的PD-1抗体拥有较高纯度。ELISA实验表明从100mL细胞上清中纯化出的抗体质量约在45μg。经浓缩后，浓度为40μg/mL。
　　最后，我们从人的外周血单个核细胞中分离和培养了DC和T细胞。用重组腺病毒Ad35-TP53感染DC，再用该DC去致敏初始T细胞，获得了TP53特异性的CTL。在CTL杀伤肿瘤细胞的体外实验中，我们设置了加PD-1抗体的实验组和不加PD-1抗体的对照组。采用CCK8试剂盒做出的杀伤数据显示实验组的杀伤效率均高于对照组10个百分点。
　　目前本课题已完成了从Ad35-anti-PD-1重组腺病毒的构建到体外杀伤的部分实验，证明了PD-1抗体体外增强CTL抗肿瘤功能。接下来用Ad35-anti-PD-1感染T细胞，让其分泌PD-1抗体，从而在CTL培养和治疗的不同环节阻断PD-1信号，全面增强CTL的活性，提高CTL过继细胞治疗的疗效。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 绪论

1 CTL的过继细胞治疗

1．1 CTL的分群

1．2 活化CTL的特异性抗原

1．3 CTL特异性抗肿瘤的机制

1．4 CTL的体外培养

1．5 CTL的临床应用及提高疗效的途径

2 抗肿瘤免疫中的PD-1抑制信号

2．1 PD-1和PD-L1分子的表达

2．2 PD-1抑制T细胞活性的机制

3 本课题研究方案及目的

3．1 研究方案

3．2 本课题的研究目的

第二章 重组腺病毒载体Ad35-anti-PD-1的构建、鉴定、扩增及滴度测定

1 前言

2 实验器材

2．1 实验材料

2．2 实验仪器

2．3 实验试剂

2．4 实验所需引物

2．5 实验试剂的配置

3 实验方法

3．1 pCB218-anti-PD-1的构建

3．2 Ad35-anti-PD-1的重组、扩增和纯化

4 实验结果

4．1 pCB218-anti-PD-1的构建结果

4．2 重组腺病毒Ad35-anti-PD-1鉴定

4．3 重组腺病毒Ad-anti-PD-1的滴度测定

5 讨论

6 总结

第三章 PD-1抗体的表达、检测和纯化

1 前言

2 实验器材

2．1 实验材料

2．2 实验仪器

2．3 实验试剂

2．4 主要试剂配置方法

3 实验方法

3．1 Ad35-anti-PD-1感染293细胞

3．2 Elisa检测PD-1抗体的表达量

3．3 Western blotting检测PD-1抗体重链和轻链的分子量

3．4 PD-1抗体的Protein G纯化

3．5 考马斯亮蓝检测纯化的PD-1抗体的纯度

3．6 ELISA检测纯化的PD-1抗体的浓度

4 实验结果

4．1 293细胞上清中PD-1抗体的表达量

4．2 PD-1抗体重链和轻链的鉴定

4．3 纯化后的PD-1抗体纯度检测

4．4 纯化的PD-1抗体的浓度

5 讨论

6 小结

第四章 PD-1信号被阻断的CTL对肿瘤细胞的杀伤

1 前言

2 实验器材

2．1 实验材料

2．2 实验器材

2．3 实验试剂

2．4 实验试剂的配置

3 实验方法

3．1 外周血单个核细胞的分离

3．2 提呈TP53抗原的成熟DC的培养

3．3 尼龙毛柱法分离T淋巴细胞

3．4 Westernbiotting检测成熟DC中TP53的表达

3．5 流式细胞术检测成熟DC的表型

3．6 混合淋巴细胞反应

3．7 ELISPOT检测p53特异性的CTL IFN-γ的分泌

3．8 PD-1信号阻断的TP 53特异性的CTL对肿瘤细胞的体外杀伤

4 实验结果

4．1 成熟DC的形态鉴定

4．2 成熟DC的表型

4．3 成熟DC中TP53表达的检测

4．4 TP53特异性的CTL IFN-γ分泌的检测

4．5 PD-1信号阻断的TP53特异性的CTL对肿瘤细胞的体外杀伤

5 讨论

6 小结

第五章 结论

参考文献

致谢

附录

pCB218-anti-PD-1质粒图谱