细胞内表达海洋来源的紫海胆、鲈鱼凝集素基因抗肿瘤的机制研究

摘要

近几十年来，国内外研究学者对凝集素，尤其是海洋凝集素产生了浓厚的兴趣，大量研究发现海洋凝集素具有显著的抗肿瘤活性。恶性肿瘤已经日益成为危害人类健康和生命的第一杀手，而传统的放、化疗治疗癌症的方法副作用大，且病人后期的生活状态极差。本课题组在过去的几年时间里对掌叶半夏凝集素基因在肿瘤细胞内表达引起的肿瘤细胞死亡及其在细胞内的作用靶点等进行了研究，结果提示我们凝集素超家族中可能存在一系列的肿瘤治疗基因。本课题研究的主要意义是寻找凝集素超家族中可能的肿瘤治疗基因。
　　紫海胆凝集素（Strongylocentrotuspurpuratuslectin，SPL）能特异识别并结合L-鼠李糖，鲈鱼凝集素（Dicentrarchuslabraxfucose-bindinglectin，DIFBL）能特异识别并结合岩藻糖;它们所具有的糖结合特异性可能为开发海洋资源及开发新型抗肿瘤药物提供新的思路和方法，因此我们选择紫海胆凝集素和鲈鱼凝集素来探究它们作为肿瘤治疗基因的可能性。
　　首先，为了研究SPL和DIFBL蛋白对肿瘤细胞的杀伤能力，我们用携带EGFP报告基因且表达SPL或DIFBL蛋白的真核表达载体转染细胞，结果显示SPL或DIFBL蛋白可进入细胞核，但其诱导细胞死亡的方式有待进一步研究。
　　随后，我们通过激光共聚焦实验初步探讨了SPL和DIFBL在肿瘤细胞内表达的亚细胞定位，这为今后寻找与SPL和DIFBL的互作蛋白奠定了坚实的理论基础。此外，我们还构建了非复制型腺病毒Ad.Flag，Ad.Flag-SPL和Ad.Flag-DIFBL;其中Ad.Flag为对照病毒。细胞毒理检测实验如MTT实验和形态学观察结果显示目的病毒能够有效的杀伤肿瘤细胞;流式细胞术结果显示目的病毒能够引起肿瘤细胞凋亡。最后，我们运用Westernblot实验技术检测了目的病毒是否引起了细胞凋亡信号通路中相关凋亡因子的变化，结果显示目的病毒使细胞凋亡抑制因子Bcl-2和XIAP表达下调，这提示我们SPL和DIFBL可能通过下调细胞凋亡抑制因子Bcl-2和XIAP引起细胞凋亡。

目录

声明

摘要

缩略词表

1 引言

1．1 海洋凝集素概述

1．2 海洋凝集素的应用前景

1．3 紫海胆凝集素的研究现状及应用前景

1．4 鲈鱼凝集素的研究现状及应用前景

1．5 现阶段肿瘤的研究进展

1．6 肿瘤的基因治疗

1．7 课题研究基础

1．8 实验方案

1．8．1 目的和意义

1．8．2 研究内容

2 实验材料

2．1 菌株与质粒

2．2 生化试剂

2．3 主要溶液配制

2．4 主要仪器

2．5 引物合成

3 实验方法

3．1 携带EGFP的表达SPL或DIFBL基因的载体构建

3．1．1 pEGFP-SPL-C1载体构建

3．1．2 pEGFP-DIFBL-C1载体构建

3．2 携带Flag、SPL或DIFBL基因的非复制性腺病毒载体的构建

3．2．1 pCA13-Flag的载体构建

3．2．2 pCA13／Flag-gene(gene=SPL、DIFBL)的载体构建

3．2．3 质粒pShuttle-gene(gene=Flag、DIFBL)的构建

3．3 细胞内表达基因片段SPL或DIFBL的亚细胞定位

3．4 SPL和DIFBL基因对肿瘤细胞的杀伤性检测

3．4．1 非复制型腺病毒的包装、纯化、扩增和滴度测定

3．5 MTT法检测细胞存活率

3．6 流式细胞术检灏细胞凋亡

3．7 Western Blot检测细胞凋亡信号通路

4 实验结果

4．1 真核表选裁体的构建及鉴定结果

4．1．1 携带SPL、DIFBL基因片段的pEGFP-SPL-C1、pEGFP-DIFBL-C1载体鉴定结果

4．2 病毒载体的构建与鉴定

4．2．1 pCA13-Flag载体构建鉴定结果

4．2．2 pCA13／Flag-SPL和pCA13／Flag-DIFBL载体构建鉴定结果

4．2．3 pShuttle-Flag和pShuttle／Flag-DIFBL载体构建鉴定结果

4．2．4 重组质粒pShuttle-Flag和pShuttle／Flag-DIFBL的鉴定

4．3 病毒的包装、扩增及滴度测定

4．3．1 Ad．Flag腺病毒的鉴定

4．3．2 Ad．Flag-SPL和Ad．Flag-DIFBL腺病毒的鉴定

4．3．3 Ad．Flag、Ad．Flag-SPL和Ad．Flag-DIFBL腺病毒的滴度测定

4．4 观察SPL或DIFBL基因细胞内表达的形态

4．5 携带SPL或DIFBL基因片段的质粒在细胞内表达的亚细胞定位

4．5．1 携带SPL基因片段的质粒在细胞内表达的亚细胞定位

4．5．2 携带DIFBL基因片段的质粒在细胞内表达的亚细胞定位

4．6 MTT法检测Ad．Flag-SPL和Ad．Flag-DIFBL对肿瘤细胞的杀伤效果

4．7 Ad．Flag-SPL和Ad．Flag-DIFBL对肿瘤细胞杀伤的形态学观察

4．8 Ad．Flag-SPL和Ad．Flag-DIFBL诱导肿瘤细胞凋亡的检测

4．9 Ad．Flag-SPL和Ad．Flag-DIFBL对细胞凋亡抑制园子表达的影响

5 讨论

6 结论

参考文献

致谢