球毛壳菌发酵产物的提取分离与生物活性研究

摘要

球毛壳菌是一种常见的腐霉菌，广泛分布于自然界的各种基物和发霉的含纤维素的日常用品上，包括植物残体、土壤、草食和杂食动物及鸟类和鼠类的粪便、种子、木材、皮革等。球毛壳菌代谢产物球主要包括麦角邕醇、大黄酚、棒曲霉素、球毛壳菌素类物质等。其中球毛壳菌素A，不仅对腐霉菌、灰霉病菌、立枯丝核菌、镰刀菌等植物病原真菌具有良好的广谱杀菌活性，同时临床证明其具有抗肿瘤活性。研究结果显示球毛壳菌素A具备良好的发展为新型杀菌剂的开发前景。
　　 本论文主要对球毛壳内生真菌代谢产物中的球毛壳菌素A的分离提取技术和发酵工艺优化进行了研究，首先建立了球毛壳菌素A的HPLC分析检测方法，然后用该方法分析后续的提取方法、发酵工艺研究，为建立产量高、成本低、无污染的规模化发酵生产工艺打下基础。同时对球毛壳菌素A的衍生化和生物活性进行了初步研究。这对于后续的对球毛壳菌素进行更好的开发为农业上重要的生物农药，及其衍生合成筛选发现更好的结构新颖的先导化合物都具有重要的研究意义。具体内容包括以下五个章节。
　　 第一章：对内生真菌代谢产物的研究现状进行了比较详细的介绍。包括内生真菌代谢产物研究的历史及其应用前景、内生真菌代谢产物的特点、内生真菌代谢产物中有效成分的检测、提取、分离方法的现状、内生真菌发酵工艺的研究进展以及内生真菌代谢产物对新药研发的影响。
　　 第二章：研究了球毛壳菌素A的提取、分离纯化方法。用不同提取方法和柱层析方法比较了其分离纯化效率。通过对比不同提取溶剂、不同提取时间，以及高效液相色谱的色谱分离情况和出峰情况来考察提取效率。发现当选用乙酸乙酯溶剂时对发酵液萃取效率最高，菌丝体用乙醇浸泡3天提取效率最高。此外用硅胶柱层析方法分离纯化球毛壳菌发酵液中乙酸乙酯提取物，考察不同洗脱剂和展开剂体系的分离效率。发现洗脱剂采用乙酸乙酯、石油醚（1:3）、展开剂体系采用乙酸乙酯、石油醚、甲酸（37:63:1）为最佳分离条件。
　　 第三章：建立了球毛壳菌发酵液浸膏中球毛壳菌素A的HPLC分析方法。通过对比采用不同色谱分析条件，对球毛壳菌发酵液中乙酸乙酯提取物的色谱出峰情况进行了考察，进一步优化了球毛壳菌代谢产物发酵过程中的检测技术。
　　 第四章：研究了球毛壳菌代谢产物发酵工艺。首先通过考察HPLC的色谱出峰情况结合生物活性测定优化了发酵时间，发现发酵13天时效价比最高。然后在PDA发酵培养基配方的基础上，采用均匀设计法，通过对其配方中碳源、有机氮源、无机氮源、无机盐等因素的考察，来进一步优化发酵培养基配方，确定发酵培养基配方中碳源和氮源最优组合为蔗糖浓度为17g/L、淀粉浓度为6g/L、蛋白胨浓度为0.5 g/L，在此条件下，发酵率可以达到0.17g/L，比目前已报道的文献值0.15g/L高0.02g/L。
　　 第五章：研究了球毛壳菌代谢产物衍生化及生物活性。通过衍生酯化对球毛壳菌素A的衍生化结构修饰进行了初步研究。同时结合滤纸片法和菌丝生长速率法证明球毛壳菌素A及其衍生化产物对终极腐霉、灰葡萄孢具有一定生物活性。

目录

文摘

英文文摘

第一章 绪论

引言

1.1 内生真菌代谢产物研究现状

1.1.1 内生真菌代谢产物特点

1.2 内生真菌代谢产物检测标准现状

1.2.1 化学发光免疫测定法（CLIA）

1.2.2 薄层色谱法（TLC）

1.2.3 气相色谱法（GC）

1.2.4 高效液相色谱法（HPLC）

1.2.5 色谱-质谱联用技术

1.3 内生真菌代谢产物有效成分提取、分离、纯化方法现状

1.3.1 常用的传统提取方法

1.3.2 常用的分离方法

1.4 球毛壳菌代谢产物研究现状

1.4.1 球毛壳菌代谢产物的种类

1.4.2 球毛壳菌代谢产物提取分离技术的研究

1.4.3 球毛壳菌代谢产物检测技术的研究

1.5 球毛壳菌发酵工艺的研究进展

1.5.1 内生真菌发酵工艺的研究现状

1.5.2 球毛壳菌发酵工艺的研究现状

1.6 球毛壳菌代谢产物生物活性及衍生化研究进展

1.6.1 球毛壳菌代谢产物生物活性的研究现状

1.6.2 球毛壳菌代谢产物生物衍生化研究现状

1.7 本论文立项依据、研究意义和研究内容

1.7.1 立项依据

1.7.2 研究意义

1.7.3 研究内容

参考文献

第二章 球毛壳菌素A的提取、分离纯化方法的研究

引言

2.1 实验部分

2.1.1 菌株、试剂及仪器

2.1.2 前期研究基础

2.1.3 球毛壳菌代谢产物的提取技术的研究

2.1.4 球毛壳菌代谢产物分离纯化技术的研究

2.2 结果与讨论

2.2.1 提取技术的色谱考察

2.2.2 分离纯化技术的考察

2.3 本章小结

参考文献

第三章 球毛壳菌素A的HPLC分析方法的研究

引言

3.1 实验部分

3.1.1 菌株、试剂及仪器

3.1.2 供试样品溶液的制备..

3.1.3 精密度实验

3.1.4 重现性实验

3.1.5 不同色谱柱的对比

3.1.6 不同流动相的对比

3.2 结果与讨论

3.2.1 精密度实验

3.2.2 重现性实验

3.2.3 不同色谱柱的出峰情况考察

3.2.4 不同流动相出峰情况考察

3.3 本章小结

参考文献

第四章 球毛壳菌代谢产物发酵工艺优化研究

引言

4.1 实验部分

4.1.1 菌株、培养基及仪器

4.1.2 发酵菌株的准备

4.1.3 不同发酵时间的对比

4.1.4 常用发酵培养基的对比

4.1.5 发酵培养基配方优化的研究

4.2 结果与讨论

4.2.1 不同发酵时间的考察

4.2.2 常用发酵培养基的考察

4.2.3 发酵培养基配方优化的研究

4.3 本章小结

参考文献

第五章 球毛壳菌素A的衍生化及生物活性研究

引言

5.1 球毛壳菌素A的衍生化研究

5.1.1 实验仪器、试剂

5.1.2 实验过程

5.2 球毛壳菌代谢产物生物活性研究.

5.2.1 实验材料

5.2.2 实验过程

5.3 结果与讨论

5.3.1 球毛壳菌素A的衍生化研究.

5.3.2 球毛壳菌代谢产物的生物活性研究

5.4 本章小结

参考文献

结束语

致谢

附录