蚯蚓蛋白质双向电泳技术的建立及菲胁迫下的蛋白质组学研究

摘要

本实验通过对蚯蚓蛋白质提取方法的比较,选择合适的样品制备方案,并对IPG胶条pH范围,等电聚焦时间,上样量等双向电泳条件进行优化,建立了适用于蚯蚓(Eisenia fetida)组织蛋白质的双向电泳技术条件。对蚯蚓进行菲的亚急性毒性试验,采用建立的双向电泳条件进行蚯蚓菲胁迫下蛋白质差异表达分析,并对部分差异表达蛋白质进行了种类鉴定,为后续开展蚯蚓蛋白质组学研究以及菲污染胁迫下土壤生物标志物的筛选奠定了研究基础。
　　 研究结果表明,改良后的TCA/丙酮沉淀法比裂解液提取法提取蚯蚓组织蛋白质效果更佳,杂质去除能力更好,所得双向电泳图谱分辨率较高,更适用于蚯蚓组织全蛋白质双向电泳样品制备。
　　 蚯蚓蛋白质组双向电泳的最佳条件为:组织通过改良的TCA/丙酮沉淀法提取总蛋白,选用pH范围4～7的IPG胶条,考马斯亮蓝凝胶染色时最佳上样量为600μg,等电聚焦时间10h。所得双向电泳图谱蛋白点丰富,背景清晰,可鉴定蛋白点超过450个。
　　 对蚯蚓进行23mg/kg菲污染20d,30d和40d三个不同时间点的自然土壤亚急性毒性实验,通过自行建立的双向电泳技术条件对蚯蚓蛋白质进行表达差异分析,分别获得显著性差异蛋白点14,22和35个,且差异蛋白表达下降趋势明显,并出现部分表达上调的蛋白质。选取5个差异蛋白点进行质谱分析,鉴定结果分别为ATP结合盒式蛋白,DNA修复酶RadA,磷酸丝氨酸转氨酶,带4.1蛋白和一个未知功能蛋白,这些蛋白质分别参与了免疫调控、遗传修复、能量代谢以及细胞骨架构成等功能。实验结果说明,菲胁迫对蚯蚓生命活动造成了很大的影响,并迫使蚯蚓启动了多种应对菲胁迫的应激反应。