疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶Lip分子改造及催化合成普瑞巴林手性中间体

摘要

普瑞巴林（S-3-氨甲基-5-甲基己酸）是抑制性神经递质γ-氨基丁酸（GABA）的结构类似物。由于良好的神经病理性疼痛和癫痫治疗效果，普瑞巴林已成为“重磅炸弹药物”。由于S-型普瑞巴林具有更强的药理活性，不对称合成普瑞巴林成为近年来的研究热点。Pfizer公司开发的第二代普瑞巴林合成工艺引入商品化脂肪酶Lipolase，选择性拆分外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯(CNDE)，生成(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸。该手性中间体经脱羧、碱性水解、氢化制得普瑞巴林。但该工艺中最关键的生物催化剂，目前只有Novozymes公司的Lipolase(来源于Thermomyces lanuginosus的商品化脂肪酶，TLL)能满足工业化生产的需要。因此，获得能够高效拆分CNDE的新催化剂，成为普瑞巴林化学酶法合成工艺的关键。本论文针对高效拆分CNDE制备普瑞巴林手性中间体新生物催化剂开发，从基因挖掘与克隆、异源表达、分子改造、催化工艺及应用等方面开展研究。
　　以立体选择性拆分CNDE为目标反应，以高效催化CNDE水解的TLL的氨基酸序列为查询序列，在GenBank数据库进行同源序列比对，筛选出与TLL同源性为78％的脂肪酶LN，然后根据ln基因序列设计引物，从T. lanuginosus DSM10635中克隆获得与ln高度同源的脂肪酶基因lip(GenBank no. KC479729)，并在Escherichia coli中活性表达。重组大肠杆菌全细胞催化CNDE水解，产物ee值达98%，E>200，但活力偏低。此外，以真菌酯酶的保守序列设计简并引物进行 PCR扩增，然后利用5′-RACE PCR获得了 T. lanuginosus DSM10635酯酶TLE的全长序列(945 bp，GenBank no. KF305767)。分别在大肠杆菌和毕赤酵母系统实现该酯酶的活性表达，并利用 Ni-NTA柱纯化TLE，研究TLE的基本酶学性质。TLE对CNDE表现出良好的选择性(E=95)，与目前报道的用于CNDE拆分的其它酯酶相比，其选择性最高，说明该酶有一定的应用潜力。
　　为了提高Lip对CNDE的水解活力，开展了基于定点饱和突变策略的分子改造研究。利用同源建模和分子对接等技术，构建了脂肪酶Lip的3D结构，分析了可能影响其活力的氨基酸残基，选择脂肪酶盖子结构附近及氧负离子洞组成氨基酸为突变位点。通过多轮点饱和突变，从突变库中筛选到活力明显提高的突变体S88T/A99N/V116D，其活力(2.35 U/mg)是野生型Lip的60.3倍，与TLL(2.40 U/mg，从Lipolase中纯化)相当。通过同源建模、分子对接研究，揭示了酶的结构-功能的关系，分析了突变体活力提高的机理：S88T突变能更有效的稳定CNDE水解反应过程中的酶-底物过渡态；A99N和V116D突变新形成三对氢键，有利于稳定酶蛋白处于盖子打开状态，从而使酶活力提高。
　　为了进一步提高Lip对CNDE的水解活力，以定点饱和突变获得的突变体Lip-T(S88T/A99N/V116D)为亲本，利用易错PCR构建随机突变库，筛选到突变体S63L/D232A，其活力是亲本Lip-T的2.0倍。为了验证这两个点突变在活力提高中的作用，利用定点突变技术分别构建单点突变体S63L和D232A，发现S63L和D232A突变对酶活的影响截然相反：S63L能有效提高酶活，单突变体S63L的活力是双突变体S63L/D232A的1.5倍；而D232A突变引起活力的降低，其活力仅为亲本的68%。为了考察其它18种氨基酸替换对活力的影响，分别构建了位点63和232的饱和突变文库，并筛选到活力更高的突变体S63M/S88T/A99N/V116D，其活力达到8.68 U/mg，为S88T/A99N/V116D的3.7倍，TLL的3.6倍，野生型Lip的222.6倍。通过同源建模发现，S63M突变引入疏水性残基，导致盖子打开程度更大，有利于底物、产物的出入，从而提高酶活。表达突变体S63M/S88T/A99N/V116D的大肠杆菌细胞(5%, w/v)能高效催化3 M(765 g/L) CNDE选择性水解，反应24 h，转化率45.2%，ee值98%，在催化剂使用量更少的情况下，已达到Lipolase(8%, w/v)拆分CNDE的水平。
　　脂肪酶催化CNDE水解过程中，产物抑制作用是影响脂肪酶催化效率的关键因素。论文进行了基于离子交换的原位吸附消除产物抑制、提高催化效率的研究，从7种代表性阴离子交换树脂中筛选出201×7，并考察了其用量对转化过程的影响。研究了加入阴离子交换树脂201×7进行原位吸附的分批转化过程，向转化体系中加入20%的树脂后，转化率达到45%所需的时间减半，催化效率加倍(3 M CNDE，反应12 h，转化率>45%)，时空产率从56.25 mmol/L/h提高到112.50 mmol/L/h，催化剂产率从1.125 mmol/h/g提高到2.250 mmol/h/g，分别是Pfizer工艺的2.0倍和3.2倍。分离转化液中的产物(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸钠，在105℃加热脱羧40 min，得到纯度>99%，ee值>99%的(S)-3-氰基-5-甲基-己酸乙酯。

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缩略词表

第一章 绪 论

1.1 普瑞巴林及其化学-酶法制备

1.2 脂肪酶

1.3 疏绵状嗜热丝孢菌及其脂肪酶

1.4 蛋白质分子改造策略

1.5 立题依据、研究意义及主要研究内容

第二章 Thermomyces lanuginosus DSM 10635脂肪酶/酯酶的克隆与表达?

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.3 结果与讨论

2.4 本章小结

?第三章 基于定点饱和突变策略的脂肪酶Lip分子改造

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.3 结果与讨论

3.4 本章小结

?第四章 基于随机突变的脂肪酶Lip分子改造

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.3 结果与讨论

4.4 本章小结

第五章 阴离子树脂原位吸附耦合生物催化CNDE

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.3 结果与讨论

5.4 本章小结

第六章 结论与展望

6.1 结论

6.2 展望

参考文献

附录

攻读博士期间发表论文与申请专利

致谢