尼古丁降解菌Pusillimonas sp.T2的筛选、鉴定、降解特性及代谢途径的初步研究

摘要

尼古丁是一种会使人上瘾或产生依赖性的生物碱，其进入人体会引起多种疾病，包括肺癌、口腔癌、食道癌、心血管病和胃功能障碍等。我国烟民数量之多，烟草生产及加工产业之庞大，产生了大量含高浓度尼古丁的烟草废弃物，给环境带来了极大的安全隐患。微生物作为环境污染物降解的主力军，其在环境修复中的应用一直被认为是高效、可靠和环境友好的。因此，发现具尼古丁降解功能的微生物，研究其降解特性及机理，探索其“变废为宝”的内在规律，是符合我国可持续性发展战略要求的，具有重大的理论意义和应用价值。
　　本研究从杭州一农药厂的活性污泥中筛选得到两株尼古丁降解菌，并选取其中降解能力更强的菌株作为本次研究的对象，命名为T2。根据其生理生化特性及其16S rDNA基因序列同源性分析，鉴定为极小单胞菌（Pusillimonas）。这是在该菌属里首次发现具有尼古丁降解能力的菌株。对T2降解特性的研究结果显示菌株T2降解尼古丁的最佳条件为:pH7.0左右，温度30℃左右，接种量100％左右，尼古丁初始浓度500 mg/L左右。
　　本研究利用紫外扫描法(UV)、高效液相色谱法(HPLC)和高效液相色谱-质谱联用法(LC-MS)共检测到六种中间代谢产物，分别为6-羟基尼古丁(6HN)，6-羟基-N-甲基麦斯明(6HMM)，6-羟基假氧化尼古丁(6HPON)，6-羟基-3-琥珀酸吡啶(HSP)，2，5-二羟基吡啶(2，5-DHP)和2，6-二羟基吡啶(2，6-DHP)。之前未见报道有中间产物2，5-DHP（吡咯烷途径产物）和2，6-DHP（吡啶途径产物）同时出现在同一菌株代谢过程中，由此我们推测T2的尼古丁降解途径可能是一条吡啶-吡咯烷结合的新途径。
　　进一步的降解实验显示，以尼古丁、6HPON或HSP为底物时降解液的颜色分别为蓝、灰蓝和绿。菌株T2以6HPON作为唯一碳源时，检测到产物HSP，2，5-DHP和2，6-DHP。在菌株T2的粗酶液中还分别检测到HSP水解酶和2，6-DHP氧化酶活性，酶活性大小分别为0.087和0.012 U/mg蛋白。这些结果进一步证明:T2先将尼古丁降解成6HN，继而6HN转变为6HMM，接着6HMM自发水解生成6HPON，然后6HPON分别通过吡啶途径和吡咯烷途径降解成2，6-DHP以及HSP和2，5-DHP。这是一条新型的尼古丁降解途径，即吡啶-吡咯烷结合途径。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 尼古丁介绍

1．1．1 尼古丁理化性质

1．1．2 尼古丁的应用

1．2 尼古丁对环境的污染现状

1．2．1 尼古丁环境污染的来源

1．2．2 尼古丁的危害

1．3 微生物降解尼古丁的研究现状

1．3．1 降解尼古丁的微生物

1．3．2 尼古丁微生物代谢途径的研究现状

1．4 尼古丁降解菌的工业应用

1．4．1 环保工业应用

1．4．2 生物工业应用

1．4．3 医药工业应用

1．5 本研究的目的、意义和主要内容及步骤

1．5．1 研究的目的和意义

1．5．2 研究的主要内容及步骤

第二章 尼古丁降解菌Pusillimonas sp．T2的筛选和鉴定

2．1 实验材料

2．1．1 菌株、试剂及仪器

2．1．2 培养基

2．2 实验方法

2．2．1 尼古丁降解菌株的富集、纯化和分离

2．2．2 降解菌株的生理生化特性的鉴定

2．2．3 菌株种属的鉴定

2．3 结果与讨论

2．3．1 尼古丁降解菌的筛选、分离和纯化

2．3．2 菌株T2的生理生化特性及其菌落形态

2．3．3 菌株T2种属的鉴定及其系统发育地位的确定

2．4 本章小结

第三章 Pusillimonas sp．T2的降解特性及代谢途径初步探究

3．1 实验材料

3．1．1 菌株、试剂和所用仪器

3．1．2 培养基

3．2 实验方法

3．2．1 菌株Pusillimonas sp．T2种子液的制备

3．2．2 尼古丁含量及中间代谢产物的检测方法

3．2．3 pH值对T2降解尼古丁的影响

3．2．4 温度对T2降解尼古丁的影响

3．2．5 接菌量对T2降解尼古丁的影响

3．2．6 初始尼古丁浓度对T2降解尼古丁的影响

3．3 实验结果与分析

3．3．1 pH值对菌株Pusillimonas sp．T2降解尼古丁的影响

3．3．2 温度对菌株Pusillimonas sp．T2降解尼古丁的影响

3．3．3 接种量对菌株Pusillimonas sp．T2降解尼古丁的影响

3．3．4 尼古丁初始浓度对菌株Pusillimonas sp．T2降解尼古丁的影响

3．3．5 代谢中间产物的鉴定

3．3．6 Pusillimonas sp．T2降解途径分析

3．4 本章小结

第四章 降解途径的初步验证及相关粗酶研究

4．1 实验材料

4．1．1 菌株、试剂和仪器

4．1．2 培养基

4．2 实验方法

4．2．1 菌株Pusillimonas sp．T2对中间产物HSP，6HPON，2，5-DHP和2，6-DHP的利用

4．2．2 蛋白定量分析标准曲线的绘制

4．2．3 菌株粗酶液的制备

4．2．4 菌株Pusillimonas sp．T2粗酶液中HSP水解酶和2，6-DHP氧化酶活性的检测

4．3 实验结果与分析

4．3．1 菌株Pusillimonas sp．T2对中间产物HSP、6HPON、2，5-DHP和2，6-DHP的利用情况

4．3．2 HSP水解酶和2，6-DHP氧化酶活性的检测结果

4．3．3 菌株T2与其他尼古丁降解菌途径的比较

4．4 本章小结

第五章 论文总结

5．1 研究内容

5．2 创新点

5．3 不足之处与展望未来

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间的研究成果