海洋微生物转化2种甾体类化合物的研究

摘要

甾体类化合物是一类具有环戊烷多氢菲类母核的化合物，甾体类化合物结构多样，种类众多，并且其中很多化合物在生命活动中扮演着至关重要的角色，在医药领域中应用也非常广泛，主要用于抗炎、抗毒、抗过敏、抗休克等，而且甾体类药物对于乳腺癌，前列腺癌等具有较好的效果。环氧黄体酮和植物甾醇均属于甾体类化合物，在医药工业中它们的转化产物广泛用于化学合成的中间体。本文通过利用海洋微生物对环氧黄体酮和植物甾醇进行生物转化，转化产物分离鉴定，并对这些化合物进行抗肿瘤活性测定，从而得到具有潜在应用价值的化合物。本文得到的结论如下：
　　（1）从中国东海海水样品中通过环氧黄体酮寡营养培养基分离纯化得到54株微生物，结合实验室保藏的15株海洋微生物，对环氧黄体酮进行生物转化，最终筛选得到三株具有环氧黄体酮转化能力的菌株，通过形态学、ITS区段基因比对和系统进化树分析，确定为米根霉Zf-5（Rhizopus oryzae），产黄青霉MNP07010101（Penicillium citrinum），枝孢霉Zf-35（Cladosporium sphaerospermum），均为课题组首次报道,具有环氧黄体酮转化能力的菌株。
　　（2）对这三株具有环氧黄体酮转化能力的海洋微生物的转化浸膏，进行分离纯化，最终获得6种环氧黄体酮转化产物，分别为11α-羟基环氧黄体酮（1），6β,11α-二羟基环氧黄体酮（2），1,4-二酮-环氧黄体酮（3），11α-羟基-6-甲基-1,4-二酮-环氧黄体酮（4），7β-羟基环氧黄体酮（5），6β-羟基环氧黄体酮（6）。对这六种转化产物进行了抗前列腺癌细胞PC-3和人乳腺癌细胞MCF-7肿瘤活性研究。首次报道化合物4对PC-3细胞具有抑制活性，其IC50值为75.7μM，其他化合物抗肿瘤效果仅优于底物环氧黄体酮。
　　（3）首次对米根霉Zf-5转化环氧黄体酮工艺进行研究，确定其最佳转化工艺为：发酵条件：葡萄糖30 g/L，蛋白胨12 g/L，培养基初始pH值7，最优接种量为5％；转化条件为：最佳转化温度为34℃，最佳转化时间为84 h，最佳底物浓度为3 g/L。此条件下环氧黄体酮总转化率达到了95%，较优化前的37.2%提高了2.5倍。
　　（4）通过植物甾醇寡营养培养基从中国东海海水样品中筛选到23株海洋微生物，结合实验室保藏的15株海洋微生物，对植物甾醇进行生物转化，结果表明，实验室保藏的海洋微生物分枝杆菌Zqc-12具有植物甾醇转化能力。对植物甾醇转化浸膏进行分离鉴定，获得5种单体化合物：1,4-雄烯二酮（7），4-雄烯二酮（8），21-羟基-20-甲基-1,4-二烯-3-酮（9），21-羟基-20-甲基-孕甾-4-烯-3-酮（10），20-羟基孕甾-4-二烯-3-酮（11）。这5种单体化合物进行抗Hela-肿瘤细胞检测后，化合物10和化合物11对Hela肿瘤细胞表现出了较高的抑制活性，其IC50值分别为9.7μM和19.3μM，其中首次发现化合物11具有对Hela肿瘤细胞的抑制活性，化合物7-11抗肿瘤活性均优于底物植物甾醇。抗肿瘤作用机制研究初步结果表明诱导细胞凋亡抑制肿瘤细胞的机理不适用于化合物10和11，其作用机理需进一步深入研究。

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符号说明

第一章 绪论

1.1 生物转化

1.2 甾体及其生物转化概述

1.3本论文研究的意义、目标与内容

第二章 环氧黄体酮转化菌种筛选

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.3 结果与讨论

2.4 小结

第三章 环氧黄体酮转化产物的分离、鉴定及抗肿瘤活性测定

3.1 引言

3.2 材料和方法

3.3 结果和讨论

3.4 本章小结

第四章 米根霉转化环氧黄体酮工艺研究

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.3结果和讨论

4.4 小结

第五章 植物甾醇的生物转化

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.3 结果与讨论

5.4 本章小结

结论和展望

参考文献

附录

致谢

攻读硕士学位期间发表论文及专利