微生物转化槐角苷制备染料木素的研究

摘要

槐角苷具有抗炎、抗生育和预防骨质疏松症等药理活性，是中药材槐角和方剂“槐角丸”中的主要成分和药理活性的基础物质。近些年来，越来越多的研究表明，槐角苷只有先被代谢为其苷元—染料木素后才能发挥药理作用，而且染料木素的抗氧化、降血脂、抗肿瘤和防治骨质疏松等生物活性显著优于槐角苷。染料木素的生产方法主要是从中药材槐角、大豆等天然原料中提取，但由于这些天然原料中染料木素含量较低，导致目前缺乏有效的生产方法。实际上，这些天然物质中，槐角苷的含量相对较高，开发以槐角苷为原料生产染料木素的转化工艺，具有潜在的工业应用价值。微生物有着非常强大的酶系和分解转化能力，如利用其糖苷酶酶转化槐角苷为染料木素，工艺具有反应条件温和，专一性强、环境友好等优点。本文采用微生物酶法生物转化槐角苷为染料木素，研究内容以及得到的结果如下:
　　首先，从槐角粉富集物中分离纯化得到10株霉菌，以这些菌株发酵所得的粗酶液生物转化处理槐角苷，比较不同菌株产酶对槐角苷的转化能力，筛选出1株能将槐角苷转化为染料木素的活性菌株LJH3。根据形态学、18S rDNA核酸序列和系统发育分析，确定该菌株为米根霉（Rhizopus oryzae）。
　　其次，以β-葡萄糖苷酶活力为指标，通过单因素实验和响应面分析，对米根霉LJH3的培养基组成进行了优化研究;以染料木素转化得率为指标，对米根霉LJH3转化槐角苷的酶解条件进行了优化。得到菌株LJH3发酵产酶的最佳工艺，在产酶培养基组成为酵母浸出粉12g/L，蛋白胨7.1g/L，麦芽糖10.8g/L，MgSO41g/L，NaCl5g/L，初始pH7.0，发酵时间为6d，β-葡萄糖苷酶的活力达到1.16U/mL;得到最佳的转化条件为:转化底物浓度1g/L，转化温度38℃，菌液稀释1倍，转化时间为24h，此时染料木素的转化得率达到了80.2％。
　　最后，比较了染料木素与槐角苷的体外抗肿瘤和抗氧化活性。采用MTT法测定染料木素和槐角苷对仓鼠卵巢细胞CHO、肾上腺嗜铬细胞瘤PC12和人乳腺癌细胞MCF-7的抑制活性;测定染料木素和槐角苷对羟基自由基和DPPH自由基的清除率来评价它们的抗氧化活性。结果表明:在两者浓度均为100μg/mL时，染料木素对CHO细胞、PC12细胞和MCF-7细胞的抑制率分别是槐角苷的6.61、1.53和3.04倍;在两者浓度均为1mg/mL时，染料木素对羟基自由基和DPPH自由基的清除率分别是槐角苷的6.15和5.51倍。说明在抑制肿瘤细胞生长和抗氧化方面，染料木素的生物活性显著优于其糖苷形式的槐角苷。

目录

声明

致谢

摘要

缩略词简表(Abbreviations)

第一章 绪论

1．1 微生物转化研究进展

1．1．1 概述

1．1．2 微生物转化的优势

1．1．3 微生物转化的反应类型

1．2 天然产物微生物转化的研究

1．2．1 概述

1．2．2 微生物转化在天然产物中的应用

1．2．3 天然产物微生物转化类型

1．3 槐角苷与染料木素的研究进展

1．3．1 槐角苷与染料木素的简介

1．3．2 染料木素药理活性研究

1．3．3 槐角苷的转化

1．4 课题研究目的与内容

第二章 槐角苷转化为染料木素菌株的筛选及鉴定

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验方法

2．3 结果与分析

2．3．1 转化菌株的富集、分离和筛选

2．3．2 转化产物的LC-MS分析

2．3．3 转化菌株的形态学鉴定

2．3．4 转化菌株的分子生物学鉴定

2．4 小结

第三章 生物转化槐角苷为染料木素工艺研究

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验方法

3．3 结果与分析

3．3．2 产酶培养基的优化

3．3．3 转化工艺的优化

3．4 小结

第四章 染料木素与其糖苷的抗肿瘤和抗氧化活性比较

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 材料

4．2．2 实验方法

4．3 结果与分析

4．3．2 槐角苷和染料木素的抗氧化活性

4．4 小结

结论和展望

参考文献

攻读硕士学位期间发表论文及专利