基于基因组与转录组测序的中国被毛孢功能基因挖掘及生物合成途径研究

摘要

冬虫夏草[Ophiocordyceps sinensis(Berk.)Sacc]是线虫草属真菌寄生在蝙蝠蛾幼虫上所形成的虫菌复合体，作为一种传统的名贵中药材在中国已有千年的历史，具有润肺、抗心率不齐、调节和增强免疫力、抗肿瘤等多种药理疗效。近年来，国内外市场对冬虫夏草的需要量剧增，价格飙升，造成人为过度采挖，虫草资源遭到严重破坏，使得人工发酵冬虫夏草菌丝体缓解市场需求迫在眉睫。本文围绕所分离的中国被毛孢菌株在基因组和转录组测序后所得到的功能基因注释信息，对参与侵染过程中的几丁质酶功能基因，对虫草酸、虫草素和虫草多糖的生物合成途径及发酵调控展开了详细的研究和探讨。
　　论文首先研究了从野生冬虫夏草中分离中国被毛孢菌株的过程。从野生冬虫夏草的菌核中分离得到了一株与中国被毛孢菌落形态高度相似的菌株。对此菌株进行电镜观察、形态学和分子生物学鉴定、Biolog鉴定及系统发育树分析，结果表明，所分离菌株的18S rDNA序列与Ophiocordyceps sinensis的18S rDNA序列最高同源性为99％;系统发育树分析发现与Ophiocordyceps sinensis和Hirsutella liboensis在进化关系上具有较亲密的亲缘关系，形成较为独立的一个分支;Biolog鉴定表明其碳源指纹图谱与Ophiocordyceps sinensis高度相似。综上可知，分离所得菌株被鉴定为中国被毛孢Hirsutella sinensis。深层发酵中国被毛孢菌株，检测发酵所得菌丝体中的主要功能活性成分，发现菌丝体中虫草酸、虫草素、粗蛋白、总多糖和粗脂肪的平均含量分别为10.90％、0.308mg/g、383.4mg/g、3.85％和5.66％，各项指标均处于或高于天然冬虫夏草对应的各指标范围，表明深层发酵中国被毛孢菌株在活性成分上与野生冬虫夏草相似。
　　为从分子水平上更好地研究中国被毛孢的功能基因，并保存这种珍贵中药的生物学信息，本文对中国被毛孢进行了基因组和转录组测序。经基因组测序及短读序列组装，获得了23198个Contigs和655个Scaffolds;经基因预测和glean软件融合，最终得到10200个蛋白编码基因，其GC含量为60.19％，平均长度为1506bp;将基因序列与各数据库进行比对，得到相应的功能注释信息（KEGG代谢通路二级分类图，COG功能分类图和GO二级分类统计直方图）。对中国被毛孢不同培养期（3D，6D和9D）的菌丝体进行转录组测序，3D样品转录组数据获得了25511个Unigene，6D样品转录组数据获得了25214个Unigene，9D样品转录组数据获得了16245个Unigene。对3D、6D和9D样品所获得的Unigene再次进行循环补沟组装，共获得20822个Unigene。对所获得的转录组功能基因进行了COG功能分类，GO功能注释分类以及KEGG功能注释分类，明确了各功能基因对应的功能;对中国被毛孢转录组进行了差异表达分析，发现3D和6D两样本间共有764个差异表达基因，3D和9D两样本间共有1869个差异表达基因，6D和9D两样本间共有770个差异表达基因。论文还从中国被毛孢转录组中挖掘和验证了两条新颖的几丁质酶基因序列chiA和chiH，chiA与Aspergillus fumigatus Af293的几丁质酶基因具有最大52％的同源性，chiH与Ophiocordyceps unilateralis的几丁质酶基因具有最大83％的同源性。诱导表达后的重组蛋白经镍柱纯化进行了酶学性质研究，结果表明，几丁质酶chiA和chiH分别在55和50℃酶活最高;几丁质酶chiA和chiH都在pH5.0时酶活最高;Mn2+、K+、Fe3+和Ba2+能够促进chiA酶活，而Ba2+能显著促进chiH酶活。考察底物特异性及酶学动力学参数，结果表明，chiA和chiH均在胶体几丁质条件下酶活最高;chiA的Vmax为1.94μmol/μg/h，kcat为1.443S-1，而chiH的Vmax为1.63μmol/μg/h,kcat为1.175S-1。
　　为提高中国被毛孢菌丝体中虫草酸和虫草素的产量，在KEGG代谢途径注释结果的基础上，研究了虫草酸和虫草素的生物合成过程，构建了生物合成途径，通过克隆、表达合成途径中功能蛋白对应的功能基因进行了验证。克隆、表达了虫草酸生物合成途径中的3种酶对应的9个功能基因，虫草素生物合成途径中的12种酶对应的16个功能基因。利用real-time PCR对虫草酸和虫草素生物合成途径中的功能基因进行了差异表达分析，发现虫草素生物合成途径中有15个表达上调和4个表达下调基因，其中5'-核苷酸酶基因显著上调表达15.03倍;发现虫草酸生物合成途径中有6个表达上调和1个表达下调基因，其中己糖激酶基因显著上调表达5.27倍，葡萄糖磷酸异构酶基因显著上调表达3.94倍。基于差异表达分析结果，考察了添加不同浓度的关键酶底物对虫草素或虫草酸生物合成途径发酵调控的影响，4mg/mL的AMP可以使虫草素产量达1.09mg/g，较对照提高了201％;5mg/mL的腺苷可以使虫草素产量达0.71mg/g，较对照组提高了96％，表明虫草素的合成更倾向于来源ADP途径。1.5mg/mL的D-葡萄糖-6-磷酸可以使虫草酸的产量达23.4％，较对照提高了55％;而3mg/mL的D-葡萄糖可以使虫草酸产量达26.6％，较对照提高了77.3％。
　　为提高中国被毛孢菌丝体中虫草多糖的产量，研究了不同硫酸盐对菌丝体中虫草多糖产量的影响以及虫草多糖生物合成途径。研究发现，在发酵起始天添加2mmol/L硫酸锰能使虫草多糖的产量达到最优值5.33％，较对照组提高了93.3％。考察了最优培养条件下中国被毛孢发酵过程中pH、剩余糖分、菌丝体生物量及虫草多糖产量的动态变化曲线，在添加硫酸锰条件下，虫草多糖产量在第8天达到峰值，其产量为5.04％，高于对照组峰值并提早达到峰值。考察了发酵过程中不同多糖前体的含量变化，在添加锰离子条件下，甘露糖含量在发酵后6天内的含量从65.32mg/g下降至37.17mg/g，减少了43.1％，较其他前体单糖消耗最为显著，被认为是最优先前体单糖;构建了虫草多糖生物合成中的甘露糖生物合成途径，并分析了其中的功能基因，通过克隆、表达，对各功能基因进行了验证。对甘露糖生物合成的功能基因进行了差异表达分析，发现cpsA基因在发酵培养后的第6天显著上调表达5.35倍，此时间点与虫草多糖达到最优产量的时间吻合，表明cpsA基因在甘露糖或虫草多糖的生物合成中发挥着重要的作用。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 引言

1．2 冬虫夏草中国被毛孢的研究进展

1．2．1 冬虫夏草的形态学特征

1．2．2 冬虫夏草的生活史研究

1．2．3 冬虫夏草产业发展状况

1．2．4 冬虫夏草的无性型研究

1．3 冬虫夏草中国被毛孢的主要活性成分及功效

1．3．1 虫草酸

1．3．2 核苷

1．3．3 虫草素

1．3．4 虫草多糖

1．3．5 其他活性成分

1．4 基因组和转录组学测序研究

1．4．1 基因组测序研究

1．4．2 转录组测序研究

1．5 冬虫夏草深层发酵及调控研究

1．6．1 体表附着阶段

1．6．2 体壁穿透阶段

1．6．3 参与侵染过程的酶

1．7 本课题的研究目的及主要内容

1．7．1 选题背景及研究目的

1．7．2 本研究的主要内容

第二章 中国被毛孢的分离、鉴定及深层发酵

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 野生冬虫夏草的采集

2．2．2 培养基、试剂及仪器

2．2．4 萌发组织的纯培养

2．2．5 培养物的菌种鉴定

2．2．6 18S rDNA序列测定及分析

2．2．7 中国被毛孢深层发酵

2．2．8 虫草酸的提取及检测

2．2．9 核苷类物质的提取及检测

2．2．10 粗蛋白和总多糖的提取及检测

2．2．11 氨基酸的提取及检测

2．2．12 粗脂肪及不饱和脂肪酸的提取及检测

2．3 结果

2．3．1 微生物形态学观察

2．3．2 微生物分子生物学鉴定

2．3．3 18S rDNA序列系统发育树分析

2．3．4 Biolog鉴定

2．3．5 菌丝体中活性成分含量分析

2．4 讨论

2．5 本章小结

第三章 中国被毛孢基因组、转录组测序及功能基因挖掘

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 实验菌株

3．2．2 实验试剂及培养基

3．2．3 实验仪器

3．2．4 中国被毛孢基因组的制备

3．2．5 中国被毛孢基因组测序

3．2．6 中国被毛孢基因组序列组装

3．2．7 中国被毛孢基因组分析

3．2．8 中国被毛孢总RNA的制备

3．2．9 中国被毛孢转录组测序

3．2．10 中国被毛孢转录组分析

3．2．11 中国被毛孢转录组基因表达注释

3．2．12 中国被毛孢转录组差异表达分析

3．2．13 几丁质酶功能基因的挖掘及生物信息学分析

3．2．14 几丁质酶功能基因的克隆、表达及蛋白纯化

3．2．15 酶学性质研究

3．2．16 酶学稳定性、底物特异性及酶学动力学研究

3．2．17 基因差异表达研究

3．3 结果

3．3．1 中国被毛孢基因组原始测序数据处理

3．3．2 中国被毛孢基因组测序短读序列组装

3．3．3 中国被毛孢基因组测序ncRNA预测

3．3．4 中国被毛孢基因组测序重复序列分析

3．3．5 中国被毛孢基因组测序基因预测

3．3．6 中国被毛孢基因组测序基因功能注释

3．3．7 比较基因组学

3．3．8 中国被毛孢总RNA的制备及检测

3．3．9 中国被毛孢转录组测序及组装

3．3．10 中国被毛孢转录组分析

3．3．11 中国被毛孢转录组功能基因COG分类

3．3．12 中国被毛孢转录组功能基因GO分类

3．3．13 中国被毛孢转录组功能基因Pathway注释

3．3．14 中国被毛孢转录组表达量分析

3．3．15 几丁质酶功能基因序列分析

3．3．16 几丁质酶功能基因的克隆、表达及蛋白纯化

3．3．17 几丁质酶的最适反应温度及温度稳定性研究

3．3．18 几丁质酶最适反应pH及pH稳定性研究

3．3．19 金属离子对几丁质酶酶活的影响

3．3．20 底物特异性及酶学动力学研究

3．3．21 几丁质酶功能基因的差异表达分析

3．4 讨论

3．5 本章小结

第四章 虫草酸和虫草素生物合成途径及发酵调控

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 实验菌株与载体

4．2．2 实验试剂及培养基

4．2．3 实验仪器

4．2．4 生物合成途径的预测

4．2．5 生物合成途径的验证

4．2．6 荧光定量PCR

4．2．7 基于生物合成途径的发酵调控

4．2．8 发酵调控后虫草酸产量的检测

4．2．9 发酵调控后虫草素产量的检测

4．3 结果

4．3．1 中国被毛孢虫草酸及虫草素生物合成途径分析

4．3．2 虫草酸及虫草素生物合成功能基因的扩增

4．3．3 虫草酸及虫草素生物合成功能基因重组质粒的构建

4．3．4 虫革酸及虫草素生物合成功能基因的异源表达

4．3．5 虫草酸及虫草素功能基因的荧光定量PCR

4．3．6 虫草酸及虫草素产量的发酵调控

4．4 讨论

4．5 本章小结

第五章 基于生物合成途径分析的虫草多糖产量提升

5．1 引言

5．2 材料与方法

5．2．1 实验菌株及培养基

5．2．2 主要实验试剂

5．2．3 主要实验仪器

5．2．4 中国被毛孢的深层发酵

5．2．5 菌丝体中虫草多糖的提取

5．2．6 葡萄糖标准曲线的绘制及多糖含量的测定

5．2．7 虫草多糖中前体单糖的含量检测

5．2．8 甘露糖生物合成途径预测及验证

5．2．9 荧光定量PCR引物设计

5．2．10 甘露糖代谢途径中功能基因的荧光定量PCR

5．3 结果

5．3．1 不同金属离子对虫草多糖产量的影响

5．3．2 不同添加剂量及时间对菌丝体生物量及虫草多糖产量的影响

5．3．3 培养基pH、剩余糖分、菌丝体生物量及虫草多糖产量的动态监测

5．3．4 发酵过程中虫草多糖前体单糖的含量变化

5．3．5 甘露糖生物合成途径的构建及验证

6．3．6 甘露糖生物合成功能基因的差异表达分析

5．4 讨论

5．5 本章小结

第六章 结论与展望

6．1 结论

6．2 论文创新之处

6．3 展望

参考文献

攻读学位期间发表的论文