一株海洋细菌群体感应抑制剂的分离与活性研究

摘要

群体感应(Quorum sensing，QS)是指通过细菌密度来协调自身的群体行为，当细菌密度增加时，信号分子（自诱导物）也增加，达到阀值时与胞内受体蛋白结合，从而调控特定基因的表达。这些特殊基因调控着细菌的许多生理功能，如生物发光、生物膜形成，细菌的聚集，胞外多糖的产生和毒力因子分泌等。与传统的抗生素相比，群体感应抑制剂(Quorum Sensing Inhibitors，OSI)是在并不影响细菌生长的情况下，抑制其有害基因的表达，因此不会引起细菌的耐药性。
　　本文通过对海洋微生物Raoultella sp.Pan22x的培养基成分和条件优化，从而提高粗提物质量和群体感应抑制活性，并通过分离纯化得到单体化合物，并对其进行活性测定来筛选新型群体感应抑制剂。同时，对Raoultella sp.Pan22x进行菌种诱变，以便得到高活性菌株。本文主要研究结果如下:
　　(1)对Raoultella sp.Pan22x发酵工艺优化，以粗提物质量和半透明圈直径为指标，通过单因素实验和正交试验，从培养基的成分和培养条件两方面来确定最佳发酵工艺，最佳培养基组成:蛋白胨浓度4％，淀粉4％，酵母浸粉0.3％，氯化钠1％，最佳培养转化条件:接种量10％，温度30℃，pH7.5，转速150r/min，培养时间96h，装液量120mL/250mL，比优化前粗提物质量提高了75.8％，比优化前活性提高了30.2％。
　　(2)对Raoultella sp.Pan22x进行大规模发酵，发酵60L，萃取得到粗提物产量为38.87g。MCI分离制备获得6个极性部分，洗脱比例体积比为水比甲醇3∶2，2∶3，1∶4以及纯甲醇有比较好的活性，最终得到10个化合物。经结构解析确定了9个化合物，7个为环二肽，分别是:为环（脯氨酸一酪氨酸）(2)，环（苯丙氨酸-脯氨酸）(3)，环(4-羟基脯氨酸-苯丙氨酸)(4)，环（脯氨酸-色氨酸）(6)，环（脯氨酸-异亮氨酸）(7)，环（脯氨酸-亮氨酸）(8)和环（色氨酸-甘氨酸）(9)，另外两个分别为吲哚乙醇(1)和色氨酸(5)。对结构鉴定的9个化合物进行群体感应抑制活性评价，在不抑制细菌生长的浓度范围内，9个化合物均能减少CV026紫色菌素的产量;化合物1，4-9可以抑制铜绿假单胞菌PAO1绿脓菌素的产量;化合物1，5和9能抑制生物被膜的产生，猜测结构的变化对群体感应抑制活性有一定的影响。化合物1-5、7-9首次从拉乌尔属中分离得到。
　　(3)对Raoultella sp.Pan22x，通过紫外线，γ射线以及抗生素诱变，对其进行群体感应抑制活性测定，通过对紫色杆菌的紫色菌素的产生以及铜绿假单胞菌绿脓菌素、弹性蛋白酶活性和生物被膜的产生等因素的考察，确定Raoultella sp.Pan22x-3，Raoultella sp.Pan22x-5和Raoultella sp.Pan22x-6为正突变菌株，群体感应抑制活性强于Pan22x，而Raoultella sp.Pan22x-1,Raoultella sp.Pan22x-2,Raoultella sp.Pan22x-4和Raoultella sp.Pan22x-7为负突变菌株，Raoultella sp.Pan22x-1，Raoultella sp.Pan22x-2和Raoultella sp.Pan22x-4没有群体感应抑制活性，Raoultella sp.Pan22x-7活性低于Raoultella sp.Pan22x。

目录

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致谢

摘要

缩略词简表

第一章 绪论

1．1 群体感应现象简介

1．1．1 革兰氏阴性菌AHL群体感应系统

1．1．2 革兰氏阳性菌群体感应系统

1．2．3 细菌中感知种间信息的群体感应系统

1．2 群体感应抑制剂简介

1．2．1 细菌群体感应抑制剂的来源

1．3 QSI的应用

1．3．1 水产养殖污染的治理

1．3．2 水产养殖病害的防治

1．3．3 在控制病原菌中的应用

1．4 本论文研究的意义、目的与内容

1．4．1 研究意义

1．4．2 研究目的

1．4．3 研究内容

第二章 Raoultella sp．Pan22x菌株发酵培养基及条件优化

2．1 引言

2．2 实验材料

2．2．1 样品采集

2．2．2 报告菌株来源

2．2．3 主要试剂

2．2．4 主要仪器

2．2．5 实验培养基

2．3．1 海洋细菌的发酵

2．3．2 海洋细菌粗提物的制备

2．3．3 活性检测

2．3．4 基础发酵培养基的选择

2．3．5 培养基组成的优化

2．3．6 培养条件的的优化

2．4 结果与分析

2．4．1 基础培养基的选择

2．4．2 培养基组成的优化

2．4．3 培养条件的的优化

本章小结

第三章 Raoultella sp．Pan22x活性化合物分离鉴定及其活性测定

3．1 引言

3．2 实验材料、试剂及仪器

3．2．1 实验菌株

3．2．2 试剂及培养基

3．2．3 实验仪器

3．3 实验方法

3．3．1 粗提物浸膏的制备

3．3．2 Raoultella sp．Pan22x粗提物的粗分离

3．3．3 制备高效液相色谱

3．3．4 化合物结构鉴定

3．3．5 群体感应抑制活性物质的活性检测

3．4 实验结果

3．4．3 Raoultella sp．Pan22x发酵产物初步分离

3．4．4 Raoultella sp．Pan22x中QSI的活性追踪分离

3．4．5 化合物的鉴定

3．4．6 对紫色菌素产量的影响

3．4．7 对绿脓菌素产量的影响

3．4．8 对PAO1生物体膜的作用

3．4．9 对丛动现象的影响

本章小结

第四章 Raoultella sp．Pan22x菌种诱变及其活性检测

4．1 引言

4．2 实验材料、试剂及仪器

4．2．1 供试菌株

4．2．2 试剂及培养基

4．2．3 实验仪器

4．3 实验方法

4．3．1 菌株Raoultella sp．Pan22x的诱变

4．3．2 对群体感应系统的影响

4．4 结论

4．4．1 诱变菌株的筛选结果

4．4．2 初步活性检测

4．4．3 对紫色素产量的影响

4．4．4 绿脓菌素产量的影响

4．4．5 对生物体膜抑制

4．4．6 对蛋白水解酶活性的影响

4．4．7 对弹性蛋白酶活性的影响

4．4．8 对PAO1丛动现象检测

本章小结

结论和展望

参考文献

硕士期间发表的论文和专利

附录