海洋芽孢杆菌GS-5次级代谢产物化学成分和生物学活性研究

摘要

海洋芽孢杆菌(Bacillus marinus)是芽孢杆菌属(Bacillus)中的一个种，因其生长环境的特殊性而可以产生一些结构新颖的生物活性物质，海洋芽孢杆菌活性代谢产物的研究目前已成为国内外研究的热点。我国是海洋大国，拥有辽阔的海域和丰富的海洋微生物资源，充分利用我国海洋微生物的优势资源，研究开发海洋微生物天然活性物质，可以从中发现很多对人类有益的微生物活性代谢产物。
　　本文对所采集的海泥样品进行生物活性测试和活性组分理化性质鉴定，最终选择GS-5菌株作为研究对象，通过PCR扩增16S rDNA序列，Blast比对并构建进化树，最终初步鉴定GS-5菌株为海洋芽孢杆菌(Bacillus marinus)。
　　采用薄层色谱、硅胶柱色谱和高效液相色谱等分离技术对菌株GS-5菌株的发酵液进行了化学成分的提取和分离，从中分离得到14个单体化合物，并利用质谱、核磁共振等现代波谱技术鉴定了他们的结构，分别为胆甾醇(cholest-4-en-3-one)(1)、邻苯二甲酸二异丁酯(Diisobutyl phthalate)(2)、7-羟基-3-(4'-羟苯基)-异黄酮-7-糖苷(7-(-D-Glucopyranosyloxy)-3-(4-hydroxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-o-ne)(3)、环（缬-脯）二肽(Cyclo(Val-Pro))(4)、N-苯乙基异戊酰胺(N-phenethylisovaleramide)(5)、3-苯基丙酸(3-Phenylpropionic acid)(6)、环（亮-羟脯）二肽(Cyclo(Leu-hydroxypro))(7)、环（苯丙-羟脯）二肽(Cyclo-(Phe-hydroxypro))(8)、4'，7-二羟基异黄酮(4'，7-dihydroxy-isflavone)(9)、环（亮-脯）二肽(Cyclo-(Leu-Pro))(10)、环（苯丙-脯）二肽(Cyclo(Phe-Pro))(11)、2-苯乙胺(2-Phenylethylamine)(12)、环（酪-脯）二肽(Cyclo-(Tyr-Pro))(13)、4'，5，7-三羟基异黄酮(4'，5，7-trihydroxy-isflavone)(14)。
　　采用纸片法对获得的6个环二肽类化合物进行生物学活性检测，结果发现化合物4、7、8、11对大肠杆菌(Escherichia coli)的活性具有抑制作用。
　　综上所述，本研究工作从海洋芽孢杆菌GS-5中分离得到14个化合物，其中化合物4、7、8、11具有抑制大肠杆菌的作用。本实验为海洋芽孢杆菌次级代谢产物中抗生素类生物活性物质的开发利用奠定了一定的生物学和化学基础。

目录

摘要

第1章 海洋细菌次级代谢产物化学成分和生物活性物质概述

1．1 海洋微生物简介

1．2 海洋细菌分类

1．3 海洋细菌产生的生物活性物质

1．3．1 抗菌活性物质

1．3．2 抗肿瘤物质

1．3．3 酶

1．3．4 酶抑制剂

1．3．5 多不饱和脂肪酸

1．3．6 毒素

1．3．7 其他活性物质

1．4 国内外研究现状分析

1．5 课题研究目的和意义

第2章 海洋芽孢杆菌GS-5的分离、保藏及菌种鉴定

2．1 实验仪器与材料

2．1．1 菌株

2．1．2 实验仪器

2．1．3 实验试剂

2．2 微生物样本的分离

2．3 菌种的发酵培养

2．3．1 发酵液的预处理

2．3．2 生物活性测试

2．3．3 菌种的复筛

2．3．4 活性组分理化性质的早期鉴定

2．4 菌种的分子生物学鉴定

2．4．1 16S rDNA基因序列测定结果

2．4．2 序列分析结果

2．5 菌种的保藏

2．6 本章小结

第3章 海洋芽孢杆菌GS-5次级代谢产物的分离纯化

3．1 实验材料、仪器与试剂

3．1．1 主要仪器设备

3．1．2 材料及试剂

3．2 实验方法

3．2．1 薄层色谱(TLC)

3．2．2 硅胶柱层析

3．2．3 高效液相色谱(HPLC)

3．3 次级代谢产物的分离纯化

3．3．1 菌种发酵

3．3．2 乙酸乙酯组分的粗分

3．3．3 GS-5-3组分的分离纯化

3．3．4 GS-5-10组分的分离纯化

3．3．5 GS-5-12组分的分离纯化

3．3．6 GS-5-16组分的分离纯化

3．4 分离纯化流程图

3．5 本章小结

第4章 化合物结构鉴定与活性研究

4．1 实验仪器与材料

4．1．1 材料与试剂

4．1．2 仪器设备

4．2 化合物鉴定方法

4．2．1 NMR分析

4．2．2 ESI-MS分析

4．3 化合物的生物学活性研究

4．4 化合物的结构和名称

4．5 化合物的结构鉴定与分析

4．5．1 化合物1的结构鉴定

4．5．2 化合物2的结构鉴定

4．5．3 化合物3的结构鉴定

4．5．4 化合物4的结构鉴定

4．5．5 化合物5的结构鉴定

4．5．6 化合物6的结构鉴定

4．5．7 化合物7的结构鉴定

4．5．8 化合物8的结构鉴定

4．5．9 化合物9的结构鉴定

4．5．10 化合物10的结构鉴定

4．5．11 化合物11的结构鉴定

4．5．12 化合物12的结构鉴定

4．5．13 化合物13的结构鉴定

4．5．14 化合物14的结构鉴定

4．6 化合物的抗菌活性检测

4．7 本章小结

第5章 结论

参考文献

附录

附录 攻读学位期间已发表的论文

致谢

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