大洋性金枪鱼物种鉴定标记的研究

摘要

金枪鱼是世界营养学会推荐的三大营养鱼类之一。金枪鱼肉的氨基酸种类齐全，配比合理;富含DHA、EPA等多不饱和脂肪酸和钾、钙、铁、锌等于人体有益的微量元素，享有“海鸡肉”、“小牛肉”等美称。目前，金枪鱼已成为国内外众多高档餐厅的高价值食品，然而金枪鱼品种繁多，价格差异很大。目前金枪鱼的分类主要依据形态学特征，以及远洋捕捞船的跟踪记录，而主要以鱼块、鱼片等不具形态特征的形式进行销售的金枪鱼，造成了市场上存在以假冒真，以次充好的掺假行为的发生。因此，开发快速准确的金枪鱼物种鉴定方法，可为检验检疫部门打击不法商贩的掺假、制假行为提供可靠的科学依据，有利于维护消费者的合法权益，规范市场管理秩序，保障金枪鱼产品的流通安全，对促进我国金枪鱼产业的健康发展具有重要意义。
　　本文以蓝鳍、黄鳍、大目、长鳍、青干、正鲣、扁舵鲣、圆舵鲣、东方狐鲣和鲔10种不同品种的金枪鱼为研究对象，通过营养分析法、DNA分子标记法、iTRAQ标记差异蛋白组学法进行了物种鉴定标记的研究。主要研究结果如下:
　　(1)通过对金枪鱼的基本成分、氨基酸、脂肪酸和无机元素等营养成分进行分析。结果发现，10种金枪鱼肉均是高蛋白低脂肪的鱼肉食品，氨基酸种类齐全，配比合理，富含DHA和EPA等多不饱和脂肪酸，还含有多种于人体有益的无机元素，是营养丰富的鱼肉食品。
　　在营养成分研究中，未发现可对10种金枪鱼进行物种区分的特征营养物质，因为不同物种之间的检测结果，均在相关标准允许的精密度检测误差范围内;此外，由于鱼龄、海况和渔场等因素的影响，部分测定数据或与已有的研究结论存在较大偏差。高值金枪鱼组与低值金枪鱼组的数据，在营养成分指标中存在交集或子集，也无法根据营养成分对金枪鱼进行高值或低值的判定。
　　基于氨基酸、脂肪酸和无机元素的结果对10种金枪鱼进行系统聚类研究，在氨基酸的聚类分析图中，黄鳍、长鳍和大目聚为一个类群，可在一定程度上反映高值金枪鱼与低值金枪鱼间的群体差异;但关于蓝鳍等其他金枪鱼的氨基酸聚类分析，与基于形态学的分类结果存在较大的差异，未能准确反映金枪鱼物种之间的区别。而基于脂肪酸、无机元素的聚类分析图与基于形态学得到的分类结果差异更大。
　　(2)通过提取10种金枪鱼及条纹四鳍旗鱼的基因组DNA并对Cytb、CR、16S rDNA、12S rDNA、COI、ATPase六种线粒体基因和ITS1核基因进行常规PCR扩增反应。除了南海海域正鲣、条纹四鳍旗鱼的Cytb基因，扁舵鲣、圆舵鲣、东方狐鲣和条纹四鳍旗鱼的ITS1基因未被扩增，其余目的基因均被成功扩增，扩增产物序列信息分析结果提交至NCBI数据库，获取登录号为KM055356-KM055424;其中鲔的16S rDNA(KM055381)、12S rDNA(KM055370)和ATPase(KM055403)基因片段为首次成功扩增。
　　通过DNA序列分析发现，本研究选择的16S rDNA和12S rDNA基因片段的保守性较强，变异性小;而基于Cytb基因片段构建的进化树，未能准确反映黄鳍、扁舵鲣、圆舵鲣以及正鲣等物种间的亲缘关系，因此本研究所选择的16S rDNA、12S rDNA和Cytb基因片段均不适合用于研究金枪鱼的物种鉴定标记。而CR、COI、ATPase和ITS1基因由于含有丰富的变异位点，具有较大的变异性，且基于这四种基因片段构建系统进化树，进化树所显示的分类关系与形态学分类结果相吻合，是进一步研究金枪鱼物种标记的合适基因区域。
　　(3)通过对10种金枪鱼进行PCR-RFLP分析。结果发现，扁舵鲣和圆舵鲣COI基因的相似度达97.1％，大目、黄鳍、蓝鳍和青干COI基因的种间相似度更高，均超过98％。经酶切位点软件分析，共有27种限制性内切酶对本研究中的金枪鱼存在酶切位点，但未能得到可将供试的10种金枪鱼进行有效区分的特异性酶切谱带。因此本研究选择的COI基因片段的PCR-RFLP指纹图谱分析，不适合用于金枪鱼的分类鉴定。
　　CR基因是三种基因中种间相似度最低的，为50.7％-88.6％，其变异程度适合作为有效的分子标记进行金枪鱼的品种鉴定。经酶切位点软件分析后，选择DdeⅠ、AfaⅠ两种限制性内切酶进行酶切分析，获得了能将10种金枪鱼有效区分的特异性酶切片段指纹图谱。
　　ATPase基因的种间相似度整体高于CR基因，通过酶切位点分析发现，基于ATPase基因的PCR-RFLP分析也可将供试10种金枪鱼区分开来。本研究选择AluⅠ、AfaⅠ两种限制性内切酶，得到10种供试金枪鱼的限制性酶切片段特异性谱带。
　　(4)建立实时荧光PCR体系对本文中的金枪鱼进行物种标记的研究。本研究中针对扁舵鲣、圆舵鲣、东方狐鲣、鲔和条纹四鳍所设计的荧光探针体系均具有较强的特异性和抗干扰能力;能满足相关金枪鱼品种的定性检测需要，可为质检部门提供可靠的检测依据。青干可以应用SYBR GreenⅠ荧光染料体系进行区分，其荧光染料标记也具有较强的物种特异性。
　　(5)应用iTRAQ标记技术对大目、青干和正鲣三种代表性金枪鱼进行差异表达蛋白的初步研究。共鉴定蛋白1510个，其中青干与大目的总差异蛋白数最多，达79个，而正鲣与大目的差异蛋白数为63个、正鲣与青干的差异蛋白数为62个。
　　筛选出金枪鱼属与非金枪鱼属的差异蛋白共16个，其中4个表达上调，12个表达下调;而差异数均在3倍以上的有4个，其中表达上调蛋白2个，包括肌球蛋白重链、醛缩酶C;表达下调蛋白2个，包括肌球蛋白4和一种未命名蛋白;而醛缩酶C的差异倍数达到1500倍以上，是金枪鱼属与非金枪鱼属理想的蛋白标记物。
　　筛选出高值金枪鱼与低值金枪鱼的差异蛋白共有16个，其中2个表达上调，14个表达下调;而差异数均在3倍以上的有5个，其中表达上调蛋白2个，包括横纹肌蛋白、丙酮酸激酶，表达下调蛋白3个，包括肌球蛋白轻链1、肌间蛋白2和肌联蛋白。丙酮酸激酶、肌间蛋白2和肌联蛋白的差异倍数均在10倍以上，尤其后两者可以反映高值与低值金枪鱼间肌肉品质的差异，是合适的蛋白标记物。

目录

摘要

缩略语

第一章 引言

1．1 金枪鱼类的生物学分类、特征、习性与分布

1．1．1 鲭科金枪鱼属

1．1．2 鲭科鲣鱼属

1．1．3 鲭科舵鲣属

1．1．4 鲭科鲔属

1．1．5 鲭科狐鲣属

1．1．6 旗鱼科四鳍旗鱼属

1．2 物种鉴定标记的方法研究

1．2．1 形态学方法在物种鉴定标记中的研究应用

1．2．2 理化分析法在物种鉴定标记中的研究应用

1．2．3 分子生物学在物种鉴定标记中的研究应用

1．3 世界金枪鱼渔业概况和物种鉴定标记的研究

1．3．1 世界金枪鱼渔业概况

1．3．2 金枪鱼物种鉴定标记的研究

1．4 立题背景和研究意义

1．5 主要研究内容

参考文献

第二章 金枪鱼类营养成分的分析及比较研究

2．1 材料与方法

2．1．1 样品的收集

2．1．2 实验主要仪器和试剂

2．1．3 实验方法

2．1．4 数据处理

2．2 结果与分析

2．2．1 基本成分的分析结果

2．2．2 氨基酸的分析结果

2．2．3 脂肪酸的分析结果

2．2．4 无机元素的分析结果

2．2．5 金枪鱼的系统聚类分析结果

2．3 讨论与小结

2．3．1 金枪鱼的营养价值

2．3．2 不同品种金枪鱼的营养成分比较

2．3．3 高值金枪鱼与低值金枪鱼的营养成分比较

2．3．4 金枪鱼的系统聚类分析

2．3．5 本章小结

参考文献

第三章 金枪鱼的DNA序列分析及系统进化树的构建

3．1 材料与方法

3．1．1 样品的收集

3．1．2 实验主要仪器和试剂

3．1．3 实验方法

3．1．4 数据处理

3．2 结果与分析

3．2．1 金枪鱼DNA提取和PCR扩增

3．2．2 金枪鱼基因序列的结果分析

3．3 讨论与小结

3．3．1 研究物种标记基因的选择

3．3．2 DNA测序分析及基因的变异信息

3．3．3 金枪鱼的分类差异研究

3．3．4 鲣属不同群体亲缘关系的研究

3．3．5 本章小结

参考文献

第四章 金枪鱼的PCR-RFLP指纹图谱分析

4．1 材料与方法

4．1．1 样品的收集

4．1．2 实验主要仪器和试剂

4．1．3 实验方法

4．1．4 数据处理

4．2 结果与分析

4．2．1 酶切位点的软件分析

4．2．2 实际酶切结果分析

4．3 讨论与小结

4．3．1 金枪鱼物种的搜集

4．3．2 PCR-RFLP指纹图谱实验的基因选择

4．3．3 金枪鱼PCR-RFLP指纹图谱的初步建立

4．3．4 本章小结

参考文献

第五章 金枪鱼的实时荧光PCR分析

5．1 材料与方法

5．1．1 样品的收集

5．1．2 实验主要仪器和试剂

5．1．3 实验方法

5．1．4 数据处理

5．2 结果与分析

5．2．1 单一物种的特异性实验分析

5．2．2 混合物种(DNA)的特异性分析

5．2．3 混合探针的特异性实验

5．2．4 克隆产物的测序验证分析

5．3 讨论与小结

5．3．1 引物、探针的设计和选择

5．3．2 cutoff值的确定

5．3．3 模板DNA、引物和探针对实时荧光体系的影响

5．3．4 本章小结

参考文献

第六章 基于iTRAQ技术关于金枪鱼生物标记物的初步研究

6．1 材料与方法

6．1．1 样品的收集

6．1．2 实验主要仪器和试剂

6．1．3 实验方法

6．1．4 数据处理

6．2 结果与分析

6．2．1 蛋白质的提取

6．2．2 肽段匹配误差分布

6．2．3 基本鉴定信息

6．2．4 蛋白质的相对分子质量分布

6．2．5 肽段序列长度分布

6．2．6 Unique肽段数量分布

6．2．7 差异蛋白信息统计

6．3 讨论与小结

6．3．1 iTRAQ技术在生物标记物中的研究

6．3．2 金枪鱼属与非金枪鱼属的差异蛋白组比较

6．3．3 高值金枪鱼与低值金枪鱼的差异蛋白组比较

6．3．4 本章小结

参考文献

结论、创新点和展望

结论

创新点

展望

博士生期间发表的论文

致谢

声明