坛紫菜酶解多糖的分离纯化及生物活性研究

摘要

坛紫菜属红藻纲，红毛菜科，俗称紫菜、乌菜，主要在我国福建、浙江等南部沿海地区多有种植，富含蛋白质、多糖和维生素，是一种食用与药用价值很高的海藻植物，所以很受人们的欢迎。紫菜味美价廉，资源丰富，综合这些特性，紫菜成为了一个研究热点。由于坛紫菜粗多糖的分子量较大，生物活性较低，为了提高坛紫菜多糖的利用价值，本文以坛紫菜粗多糖为原料，利用酶法降解粗多糖，然后将降解多糖用DEAE-52纤维素柱和Sephadex G-100凝胶柱分离纯化，对各多糖组分的组成及结构进行了表征，并研究了其生物活性。 本论文的主要研究结果如下: 1、利用水提醇沉法提取坛紫菜粗多糖(CPH)。用酶法降解粗多糖，以DPPH清除率为指标，对果胶酶、糖化酶、纤维素酶、淀粉酶、脂肪酶进行筛选，最后选择了DPPH清除率较高的果胶酶。用响应面法对果胶酶水解条件进行优化，得到的最佳工艺参数为:果胶酶浓度为50 U/mL，pH为5.0，温度为47.5℃，在此条件下反应2h，得到降解多糖(DCPH)。 2、DCPH胆汁酸结合能力和抗氧化活性都明显强于CPH。其中对牛磺胆酸钠和鹅去氧胆酸钠的结合能力较强，表现出潜在的降低胆固醇的功能。CPH和DCPH对DPPH清除率的IC50分别17.55 mg/mL、7.26 mg/mL。CPH和DCPH对羟自由基清除率的IC50分别12.32mg/mL、 7.83 mg/mL。 3、先用DEAE-52离子交换柱对DCPH进行分离纯化，收集0.3M、0.5M、0.7M的NaCl洗脱出的多糖，然后用Sephadex G-100进一步纯化，将纯化后的多糖分别命名为P1、P2、P3。 4、对P1、P2、P3进行组成分析和结构表征。结果表明，与CPH和DCPH相比，P1、P2、P3的总糖含量以及硫酸根含量都得以增加，蛋白质含量则降低。紫外可见光谱图显示没有核酸、蛋白质的吸收峰。红外扫描光谱图显示经酶解和分离纯化后的多糖的主要结构和基团没发生变化;另外，红外光谱、核磁共振氢谱和碳谱分析都表明P1、P2和P3都含有α型糖苷键和β型糖苷键。GC-MS分析结果表明:CPH、DCPH、P1、P2、P3均主要由半乳糖组成，还含有少量的葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、岩藻糖、木糖、鼠李糖。高效凝胶渗透层析法（HPGPC）测得P1、P2、P3的分子量分别是300.3 kDa、130.4 kDa和115.1 kDa，与未降解多糖CPH相比，分子量有了明显降低(CPH分子量为523 kDa)。 5、P1、P2、P3对DPPH清除率的IC50分别为6.28 mg/mL、5.82mg/mL、5.17 mg/mL;对羟自由基清除率的IC50分别为7.05 mg/mL、5.87 mg/mL、6.53 mg/mL。还原力大小P3＞P2＞P1。 6、本实验选择RAW264.7巨噬细胞为研究对象。(1) MTT法检测细胞的增值能力:当浓度在12.5 μg/mL-100 μg/mL范围内，细胞增殖能力呈现上升的趋势，且刺激24h的效果优于48h。P2和P3能够较好的促进巨噬细胞的增殖，当浓度为100 μg/mL，P2和P3的细胞增值能力是空白组的5.6和4.8倍。(2)中性红法测细胞的吞噬能力:与空白对照组相比，P1、P2、P3能显著提高细胞的吞噬能力，具有剂量依赖性。(3) Griess试剂法检测细胞NO释放能力的影响:当刺激时间为48 h时，空白组的NO释放量为14.6 μmol/L，在多糖浓度为400 μg/mL时，CPH、DCPH、P1、P2、P3的NO释放量分别为98.46、127.06、 110.28、 140.71、146.28 μmol/L。

目录

摘要

论文说明

第1章引言

1．1坛紫菜的概述

1．2坛紫菜的化学组成

1．3多糖的研究进展

1．3．1粗多糖的提取方法

1．3．2多糖的降解

1．3．3多糖的分离纯化

1．3．4多糖的生物活性研究概况

1．4坛紫菜多糖的研究进展

1．5研究思路与意义

1．6本文研究内容

第2章坛紫菜粗多糖的制备及酶降解条件的优化

2．1材料和仪器

2．1．1主要试剂

2．1．2实验设备

2．2实验方法

2．2．1坛紫菜粗多糖的制备

2．2．2 DPPH清除能力测定

2．2．3坛紫菜多糖的降解

2．3结果与分析

2．3．1酶的选择

2．3．2果胶酶降解坛紫菜多糖单因素条件的优化

2．3．3响应面优化降解条件

2．3．4响应面分析

2．3．5果胶酶降解时间的确定

2．4本章小结

第3章坛紫菜降解多糖的胆酸结合能力及抗氧化活性研究

3．1材料和仪器

3．1．1主要试剂

3．1．2实验仪器

3．2实验方法

3．2．1体外胆汁酸结合实验

3．2．2 DPPH清除能力测定

3．2．3羟自由基清除能力

3．2．4还原力的测定

3．3．1胆酸含量测定结果

3．3．2 DPPH的清除能力

3．3．3羟自由基清除能力

3．3．4还原力

3．4本章小结

第4章坛紫菜酶解多糖的分离纯化及抗氧化活性研究

4．1材料与仪器

4．1．1材料与试剂

4．1．2实验仪器

4．2实验方法

4．2．1 DEAE-52柱层析分级纯化坛紫菜酶解多糖

4．2．2 Sephadex G-100凝胶柱层析纯化

4．2．3化学组成分析

4．2．4黏度的测定

4．2．5多糖抗氧化活性的研究

4．3结果与分析

4．3．2 Sephadex G-100层析柱结果

4．3．3化学组分分析

4．3．4分子量

4．3．5单糖组成

4．3．6红外光谱分析

4．3．7紫外光谱分析

4．3．8核磁共振图谱分析

4．3．9多糖抗氧化活性研究

4．4本章小结

第5章坛紫菜多糖对RAW264．7巨噬细胞免疫作用的研究

5．1材料与仪器

5．1．2主要仪器

5．2实验方法

5．2．1试剂的配制

5．2．2噬细胞RAW264．7的复苏、传代、冻存

5．2．3 RAW264．7细胞实验前处理

5．2．4 MTT法测定坛紫菜多糖对RAW264．7细胞增殖能力的影响

5．2．6 Griess法测定坛紫菜多糖对RAW264．7细胞分泌NO的影响

5．3结果与分析

5．3．1坛紫菜多糖对RAE264．7巨噬细胞增值的影响

5．3．2坛紫菜多糖对RAW264．7巨噬细胞吞噬的影响

5．3．3坛紫菜多糖对RAW264．7释放NO能力的影响

5．4本章小结

6．1结论

6．2创新点

6．3展望

参考文献

附录

致谢

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