李斯特菌分子鉴定与分型及其在安全牛奶生产中的应用

摘要

该项目首先对FDA法、NGFIS法和国标法三种李斯特菌选择性增菌肉汤进行对比试验,结果表明:改良的NGFIS法对环境样品李斯特菌的分离率最高,FDA法对消毒牛奶中李斯特菌的检出率最高.该试验以具有李斯特菌种、属特异性的iap基因和单核细胞增多性李斯特菌特异的溶血素基因(hlyA)作为靶目标,分别设计单一PCR、双重PCR和三重PCR来鉴定李斯特菌,并比较了三种PCR方法的特异性.结果表明:建立的单一PCR只能鉴定Lm,而双重PCR和三重PCR方法对于李斯特菌属和Lm标准株均具有良好的特异性,但是双重PCR不能鉴定部分Lm食品分离株,而三重PCR不仅可用于李斯特菌属细菌的特异性鉴定还可用于混合培养物中Lm的特异性鉴别.该研究还建立了用于追踪牛奶加工过程中Lm污染源和污染途径的RAPD分型方法,为了提高RAPD分型法的重复性和分辨力,该研究采用两条随机引物分别进行RAPD,综合分析结果的策略.结果表明:建立的RAPD方法对17株不同来源的Lm分离株均具有良好的分型性和分辨力、并对L.innocua亦有良好的分辨力和可分型性.总之,该试验所建立的三重PCR和RAPD分型方法为进一步开展牛奶生产加工过程中李斯特菌污染的监控奠定了基础.

目录

摘要

ABSTRACT

前言

第一部分文献综述

第一章单核细胞增多性李斯特菌流行病学研究进展

一、生长特性

二、分布

三、传播途径

四、易感人群和动物及临床表现

五、人类李斯特菌病发病情况

第二章食品中单核细胞增多性李斯特菌快速检测研究进展

一、选择性增菌

二、免疫学检测方法

三、核酸探针检测方法

四、PCR检测方法

1.基于毒力基因的PCR检测

2.基于特异序列的PCR检测

3.磁免疫PCR检测

第三章单核细胞增多性李斯特菌分子分型的研究与应用

一、单核细胞增多性李斯特菌分子分型概述

1.分型的理论依据

2.分型系统的评估标准

二、单核细胞增多性李斯特菌的PFGE分型研究

1.PFGE分型原理

2.PFGE用于Lm分型研究

3.PFGE分型的应用

三、单核细胞增多性李斯特菌的RAPD分型研究

1.RAPD分型原理

2.RAPD用于Lm分型研究

3.RAPD分型的应用

参考文献

第二部分研究内容

第一章李斯特菌选择性增菌培养和分离方法

一、材料

1、菌株

2、培养基

3、化学试剂

4、样品

二、方法

1.PALCAM肉汤的优化实验

2.环境和食物样品中李斯特菌的分离

三、结果

1.氯霉素对Lm和B. cereus的抑制作用

2.改良PALCAM肉汤对不同李斯特菌和B.cereus增菌效果

3.FDA法、改良NGFIS法和国标法对不同样品李斯特菌的检出结果

四、讨论

参考文献

第二章单核细胞增多性李斯特菌PCR鉴定法研究

一、材料

1.菌株

2.培养基与试剂

3.仪器

二、方法

1.细菌的培养与DNA抽提

2.PCR引物的设计与合成

3.PCR反应

4.引物浓度和PCR扩增条件的优化

5.三重PCR对Lm检出的抗干扰能力

三、结果

1.不同组合引物浓度及PCR扩增条件的优化

2.单一PCR扩增结果

3.双重PCR扩增结果

4.三重PCR扩增结果

5.三重PCR 对Lm检出的抗干扰能力

6.PCR法对李斯菌鉴定和Lm鉴别能力的比较

7.PCR、API和ELISA鉴定法的比较

四、讨论

参考文献

第三章单核细胞增多性李斯特菌RAPD分型研究

一、材料

1.菌株

2.试剂

3.仪器设备

二、方法

1.细菌的培养与DNA的抽提(抽提试剂见附录2)[1、2、3]

2.RAPD反应体系和扩增程序的优化

3.引物的筛选

4.Lm分离株RAPD分型

三、结果

1.模板DNA浓度

2.RAPD反应体系和扩增程序的优化

3.酶和dNTP优化浓度

4.引物筛选

5.Lm分离菌株的RAPD分型

四、讨论

参考文献

第四章李斯特菌PCR鉴定和RAPD分型技术在安全牛奶生产中的应用

一、材料

二、方法

1.样品的采集与处理

2.李斯特菌的选择性增菌分离

3.李斯特菌的PCR鉴定与API鉴定

4.李斯特菌RAPD分型

三、结果

1.各种样品的李斯特菌检出

2.L.innocua分离株RAPD分型结果

四、讨论

参考文献

结论

致谢

附录1.培养基

附录2.试剂