白菜雄性不育相关基因CYP86MF的功能验证及其人工不育系的创建

摘要

在国家自然科学基金委的资助下，我们在前一阶段利用mRNA差异显示技术从白菜核雄性不育两用系中分离得到了一个与白菜核雄性不育相关的编码细胞色素P450基因CYP86MF.该基因具有一个完整的长1578bp的开放阅读框，经GenBankBLAST查询表明，CYP86MF与位于拟南芥第一条染色体上的编码细胞色素P450基因CYP86MF核苷酸序列有85.3﹪的同源性，氨基酸同源率为84.9﹪;Northern验证表明CYP86MF基因在白菜两用系不育株中的表达受到了明显地抑制，并且该基因在花蕾中特异表达，菜和菜心的高效再生体系，以及构建了植物表达载体的基础上，我们采用反义技术将可育株高表达的CYP86MF基因中约460bp的片段导入正常可育白菜和菜心中，得到了130多株转化植株，其中开花结果的有37株，除2株为嵌合的不育株以及3株的花器官畸形（花朵变大、花瓣变窄以及嵌套花）以外，其余的转在因植株花器官外观形态正常，但单株自交不能正常结实，蕾期授粉亦然.由此我们进行了转基因植株的花粉萌发试验，结果显示，转基因植株的花粉不能正常萌发，而非转化对照株的花粉萌发率可达25﹪～30﹪.由此，我们分析了转基因不育植株与正常可育植株及其两用系材料之间CYP86MF基因的表达特征，对转基因植株及其对照株之间的小孢子的形态和细胞发育过程进行了观察，比较了它们之间有关生理生化指标的差异，从而为探讨CYP86MF基因在芸薹属植物小孢子发育过程中的作用机制提供了一引起信息.

目录

文摘

致谢

缩写词

0前言

1植物雄性不育与细胞色素P450研究进展

1.1植物雄性不育产生机制的研究

1.1.1 CMS和NMS遗传控制模型

1.1.2雄性不育遗传的连锁控制模型

1.1.3光温启动子假说

1.1.4雄性不育遗传的双基因模型

1.2植物转基因雄性不育的研究

1.2.1创造基因工程雄性不育系的途径

1.2.2基因工程雄性不育系的保持途径

1.2.3基因工程雄性不育系的恢复途径

1.2.4基因工程创造雄性不育系的研究展望

1.3细胞色素P450的研究

1.3.1植物细胞色素P450的分离纯化与反应类型

1.3.2植物CYP450的功能

1.3.3植物细胞色素P450研究展望

2高效白菜离体培养植株再生体系的建立

2.1材料和方法

2.1.1无菌苗的获得

2.1.2外植体及接种方式

2.1.3培养基的组成

2.1.4再生植株的生根与移栽

2.1.5不定芽发生的组织学研究

2.2结果与分析

2.2.1 BAP与NAA配比对白菜子叶-子叶柄植株再生频率的影响

2.2.2白菜外植体对植株再生频率的影响

2.2.3 AgNO3对白菜再生苗不定根诱导的影响

2.2.4白菜子叶-子叶柄离体不定芽发生的组织学观察

2.3 讨论

3改良菜心离体培养植株再生体系的研究

3.1材料和方法

3.2结果与分析

3.2.1不同激素组合对菜心不定芽分化频率的影响

3.2.2不同外植体对菜心不定芽分化频率的影响

3.2.3 AgNO3对菜心不定芽分化的影响

3.3讨论

4反义CYP86MF基因植物表达载体的构建

4.1材料与方法

4.1.1菌株和质粒

4.1.2反义CYP86MF基因片段的获得

4.1.3 CaMV35S组成型启动子的表达载体构建

4.1.4 A9启动子组织特异型表达载体的构建

4.2结果与分析

4.2.1反义CYP86MF基因片段的获得

4.2.2 CaMV35S组成型启动子的表达载体构建

4.2.3 A9启动子绒毡层组织特异型表达载体的构建

4.3讨论

5高效白菜和菜心的遗传转化体系的建立

5.1材料与方法

5.1.1植物材料、菌株及抗生素

5.1.2培养基

5.1.3子叶柄-子叶不定芽分化与种子发芽的Kan筛选浓度的确定

5.1.4不同抗生素的抑菌效果及其对不定芽分化影响的比较

5.1.5不同预培养时间的比较

5.1.6不同农杆菌菌株感染效果的比较

5.1.7不同共培养时间的比较

5.1.8不同介导方法的比较

5.1.9白菜和菜心反义CYP86MF片段转化植株的获得

5.2结果与分析

5.2.1白菜和菜心子叶柄-子叶不定芽分化与种子发芽的Kan筛选浓度的确定

5.2.2不同抗生素的抑菌效果及其对不定芽分化影响的比较

5.2.3不同预培养时间的比较

5.2.4不同农杆菌菌株感染效果的比较

5.2.5不同共培养时间的比较

5.2.6不同介导方法的比较

5.2.7白菜和菜心反义CYP86MF片段转化植株的获

5.3 讨论

5.3.1Kan筛选浓度及抑菌剂对白菜遗传转化的影响

5.3.2预培养、菌株和共培养对白菜遗传转化的影响

5.3.3不同介导方法对白菜遗传转化的影响

6转基因植株的分子检测及其遗传特性分析

6.1材料与方法

6.1.1材料

6.1.2植物基因组DNA和总RNA的提取

6.1.3转化植株的PCR检测

6.1.4转化植株的Southern斑点杂交检测

6.1.5转化植株的Southern印迹杂交检测

6.1.6转化植株的Northern印迹杂交检测

6.1.7转化植株的X-Gluc组织化学染色检测

6.1.8转基因植株T1代种子的Kan.筛选

6.1.9转基因植株T1代的遗传特性的分析

6.2结果与分析

6.2.1植物基因组DNA和总RNA的提取

6.2.2转化植株的PCR检测

6.2.3转化植株的Southern斑点杂交检测

6.2.4转化植株的Southern印迹杂交检测

6.2.5转基因植株的Northern杂交检测

6.2.6转化植株的X-Gluc组织化学染色检测

6.2.7转基因植株T1代种子的Kan.筛选

6.2.8转基因植株T1代的遗传特性分析

6.3讨论

6.3.1植物基因组DNA和总RNA的提取

6.3.2反义CYP86MF基因转化植株的检测

6.3.3反义CYP86MF基因转化植株的遗传分析

7反义CYP86MF基因转化植株小孢子发育的形态与细胞学观察

7.1材料与方法

7.1.1试验材料

7.1.2转基因植株花器官的形态学观察

7.1.3转基因植株的花粉萌发试验

7.1.4低温干燥条件下不同贮藏时间对花粉萌发的影响

7.1.5转基因不育植株小孢子的形态学观察

7.1.6转基因不育植株小孢子的细胞学观察

7.2结果与分析

7.2.1转基因植株花器官的形态学观察

7.2.2转基因植株花粉萌发试验

7.2.3低温干燥条件下不同贮藏时间对花粉萌发的影响

7.2.4转基因不育植株小孢子的形态学观察

7.2.5转基因不育植株小孢子的细胞学观察

7.3讨论

8反义CYP86MF基因转化不育植株相关生理生化指标的测定

8.1材料与方法

8.1.1试验材料

8.1.2转基因不育植株激素水平的变化

8.1.3转基因不育植株呼吸速率和抗氰呼吸强度的测定

8.1.4转基因不育植株光合速率的测定

8.1.5转基因不育植株总黄酮含量的测定

8.1.6转基因不育植株过氧化物酶和细胞色素氧化酶同工酶的电泳分析

8.2结果与分析

8.2.1转基因不育植株激素水平的变化

8.2.2转基因不育植株呼吸速率和抗氰呼吸强度的测定

8.2.3转基因不育植株净光合速率的测定

8.2.4转基因不育植株总黄酮含量的测定

8.2.5转基因不育植株过氧化物酶和细胞色素氧化酶同工酶的电泳分析

8.3讨论

8.3.1反义CYP86MF基因转化不育株内源激素的变化

8.3.2反义CYP86MF基因转化不育株呼吸速率和抗氰呼吸的变化

8.3.3反义CYP86MF基因转化不育株类黄酮总含量的变化

8.3.4反义CYP86MF基因转化不育株过氧化物酶和细胞色素氧化酶同工酶的变化

8.3.5 CYP86MF基因对白菜小孢子发育的可能作用机制

9结论

参考文献

ABSTRACT

申请者攻读博士学位期间发表的文章目录