人葡醛酸缀合反应转移酶1A9在中国仓鼠肺细胞CHL中的表达及其对药物的代谢研究

摘要

葡萄糖醛酸转移酶（UDP-Glucuronosyltransferases,UGTs）是一类位于内质网上的膜结合糖蛋白,它是药物Ⅱ相代谢中的一个基因超家族.该实验在国内率先建立了UGT1A9的转基因细胞系,运用DNA重组技术,采用pREP9作为表达载体,在中国仓鼠肺细胞中使UGT1A9得到了有效地表达,并且以此作为研究葡醛酸代谢的体外试验模型,开展了一些药物的葡醛酸缀合反应研究,预测药物经葡醛酸缀合反应代谢所蕴涵的代谢特征.由于UGT1A9主要催化羟基的葡醛酸缀合反应,该实验选择具有不同结构类型的含羟基化合物作为底物,一类是羟基处于芳环的异丙酚和扑热息痛;另一类是羟基处于脂链的普萘洛尔和普罗帕酮.该实验选择了四种类黄酮化合物即槲皮素、山萘酚、异鼠李素和芦丁作为底物,观察UGT1A9对它们代谢的作用情况,试图了解UGT1A9在这些化合物的葡醛酸代谢过程中所起的作用.1、UGT1A9基因的克隆和表达质粒的构建：采用RT-PCR方法从人肝组织中分别克隆出UGT1A9的cDNA,通过克隆载体pGEM-T扩增后,用双酶切组成粘性末端与pREP-9表达载体连接.2、转基因细胞系的建立：用改进的磷酸钙介导的细胞转染法将构建好的重组质粒pREP9-UGT1A9转染培养的CHL细胞,通过G418筛选一个月后获得转基因细胞系,建立了CHL-UGT1A9转基因细胞系.3、转基因细胞系的鉴定：通过DNA序列测定,所获得的UGT1A9克隆与基因库序列（GenBankaccessionno.AF056188）的基因片段完全相符.4、用转基因细胞系CHL-UGT1A9进行的芗代谢分析：用转基因细胞系CHL-UGT1A9进行了对一组药物进行了葡醛酸缀合反应的代谢分析.已经证实,UGTs是一种位于内质网上具有I型拓扑结构的膜结合糖蛋白,通过研究跨膜区和接近细胞膜的胞质区对UGT活性的作用,了解到穿膜区的存在对于UGT活性是一个关键的因素,而胞质区似乎是非必需的,只是调节酶的活性.迄今为止,还没有任何UGTs蛋白的结构得到解析,也没有人通过蛋白质的大量制备用X-衍射或NMR方法测定出UGTs蛋白的空间构型.该项目通过测定UGTs对底物的代谢活性,了解葡醛酸缀合转移酶与代谢底物化学结构之间的关系,对于确定蛋白质构象有重要的意义.

目录

研究论文

前言

实验材料

基本实验操作

实验方法

实验结果

讨论

结论、研究意义与展望

参考文献

综述一药物ⅠⅠ相代谢途径与相关酶系的研究进展

综述二药物在人体内的葡醛酸缀合反应

在读博士期间的业绩

致谢