一氧化氮还原酶催化亚基编码基因（cnorB）在反硝化细菌种群分析中的应用研究

摘要

一氧化氮(NO)是反硝化过程中必经的中间产物,同时NO又是一种细胞毒素,细胞代谢导致NO的积累极大地威胁着细胞的生命,所以及时地清除NO对细胞来说是十分必要的.一氧化氮还原酶(Nor)负责把一氧化氮还原成无毒的一氧化二氮.另外,一氧化氮(NO)在生物脱氮的过程中也占据着重要的地位.所以用一氧化氮还原酶基因作为分子标记对反硝化细菌进行种群分析和系统发生研究是可行的.以前曾有对narG、narH(nitrate reductase,硝酸盐还原酶)基因、nirK、nirS(nitrite reductase,亚硝酸盐还原酶)基因和nosZ(nitrous oxide reductase,一氧化二氮还原酶)基因设计特异性引物,进行PCR扩增对环境样品中的硝化细菌和反硝化细菌进行种群分析的报道,但是却一直没有利用norB(nitric oxidereductase,一氧化氮还原酶)基因对反硝化细菌进行种属研究的报道.直到2003年Gesche Braker等人才设计出特异于norB基因的PCR引物,促进了对反硝化细菌分类学研究的发展.一氧化氮还原酶(Nor)有两个亚基:NorB亚基和NorC亚基.NorB被证明包含有活性位点,是具有催化活性的亚基,由cnorB基因编码.这种酶被称为cNor酶.1997年Cramm等人又发现了一种新的一氧化氮还原酶,该酶是单体酶,为cNor酶中的NorB催化亚基的同源体,由对苯二酚(quinol)作为电子供体,所以被称为qNor,由qnorB基因编码.该试验通过设计一对特异于编码一氧化氮还原酶cNor催化亚基NorB的基因cnorB的引物,对一炼化厂生物硝化池曝气塘中的土著菌群进行种群分析.对PCR结果的17个克隆作RFLP分析,最后筛选出5个克隆进行测序、同源性比对.并运用Blast和Fastx程序进行检索.然后用Emboss、Clustal进行全局联配,找出其同源关系,建立系统发育进化树.

目录

摘要

Abstract

前言

材料与方法

1 cnorB基因片段的PCR扩增及条件优化

1.1试验材料

1.2方法

2 cnorB基因片段的克隆与序列分析

2.1材料

2.2方法

结果

1 cnorB基因片段的PCR扩增及条件优化

1.1活性污泥中总DNA的快速抽提

1.2模板DNA浓度的测定

1.3 conrB基因片段PCR最佳反应体系的建立

2 cnorB基因片段的克隆与序列分析

2.1 cnorB基因片段的克隆与鉴定

2.2 conrB基因片段的序列测定

2.3 conrB基因片段的同源性分析

2.4系统进化树

讨论

1 cnorB基因片段特异性扩增及PCR条件的优化

1.1 cnorB基因片段特异性扩增引物的设计

1.2 PCR反应体系的优化

2 PCR产物的克隆

3转化子的筛选与鉴定

综 述:一氧化氮还原酶（norB）基因在反硝化细菌种群分布及系统发生研究中的作用

参考文献

致谢