一种与微系统兼容的大肠杆菌活细胞检测方法研究

摘要

通常来讲，大量的病原微生物活跃在包括空气、水源、土壤以及食物等人们日常生活环境中。为了更好的维护公众健康，快速而准确的环境评估就显得十分必要，尤其是针对致病菌等微生物的活性检测，因为大多数情况下只有活的菌体才会对人类产生威胁。然而在实际操作中，检测速度与轻便性却是在开发及时有效的细菌活性检测方法过程中不得不面对的挑战。传统的病原微生物活性检测依赖于以细菌培养为基础的分析手段，但这样的方法通常都比较耗费时间，同时还必须依赖于实验室特有的设备，难以达到便携化现场监测的要求。而近些年随着微器件加工技术的飞速发展，已经有越来越多的生物分析过程可以成功地在微型分析系统(芯片实验室labonachip或微全分析系统micrototalanalysissystem，μTAS)上演示。以微型化的形式进行生物检测有着很多优越性，例如较小的样本体积与较少的试剂消耗。除此之外，其在一微小器件上集成多种操作模块的能力以及随之而来带给开发真正意义上便携式分析设备的希望，使得很多研究者都投身到这一领域中来。然而目前为止，对于如何在微型分析系统上实现进行微生物活性检测的方法研究还很有限。 本文着重研究一种具有微系统兼容性的对活性大肠杆菌进行快速检测的方法，以期应用于食物与水体等的质量监控。在这一方法中，大肠杆菌热激蛋白(heatshockprotein，hsp)GroEL的mRNA被用作细胞活性的标志物，通过检测这种物质的存在已否来判断细胞活性。整个策略从对大肠杆菌细胞进行可控的高温热激开始(47℃，20分钟)，在这一过程中标志物GroELmRNA被转录。之后，引入能与指示物mRNA特异性配对的5'端生物素标记的捕获探针与目标mRNA分子杂交，再加入亲和素修饰的磁性颗粒与捕获探针进行共价结合，这样细胞活性的标志物GroELmRNA就可以通过外加磁场与其他细胞杂质分离。 最后，在经过RT-PCR(reverse-transcriptionpolymerasechainreaction)对标志物的放大后，最终信号的定量分析采用传统的凝胶电泳或基于Ag/Au电化学反应的方法来检测。 在研究GroELmRNA对细胞活性的表征特性中发现，热激温度与持续时间等条件对标志物mRNA的转录水平有着很大影响；同时还发现热激过程后一旦环境温度回到室温状态下，目标mRNA会在几分钟内自行降解。在mRNA磁性分离的过程中，对分离的特异性、可重复性以及DNA污染等问题也分别进行了研究。最后，实验验证了基于Ag/Au电化学反应的分析方法具有比常规凝胶电泳更为灵敏的检测范围并可区别出菌体浓度达到102cfu/ml的大肠杆菌样品。 本文所研究的检测方法充分考虑了在微型系统上的适用性。在此方法的基础上，可以预见一种可以用于活性微生物检测的集成生物分析微系统的开发会在不远的将来实现。

目录

文摘

英文文摘

第1章文献综述

1.1. 前言

1.2. 微生物活性检测方法概述

1.2.1. 基于细胞代谢活性的检测方法

1.2.2. 基于细胞完成性的检测方法

1.2.3. 基于细胞内核酸分子的检测方法

1.3. 微型生物分析系统及芯片实验室

1.3.1. 样品的处理

1.3.2. 信号的检测

1.3.3. 微全分析系统与芯片实验室

1.4. 用微分析方法或系统进行细胞活性检测的研究进展

1.5. 本文的研究思路

第2章实验材料与方法

2.1. 菌种与培养基

2.2. 试剂与器材

2.2.1. 主要试剂

2.2.2. 主要器材

2.2.3. 所用溶液与缓冲液配方

2.3. 实验操作及分析方法

2.3.1. 大肠杆菌培养条件

2.3.2. 大肠杆菌生长的测定

2.3.3. 大肠杆菌的热激条件

2.3.4. mRNA的提取与分离

2.3.5. GroEL mRNA的RT-PCR扩增及电泳检测

2.3.6. RT-PCR产物的电化学分析

第3章大肠杆菌细胞活性的表征

3.1. 细胞活性指示物的选定

3.2. GroEL mRNA对细胞活性表征的特异性

3.3. GroEL mRNA在活细胞中转录的稳定性

3.4. 热激条件对细胞内GroEL mRNA含量的操纵性

3.4.1. 热激温度的影响

3.4.2. 热激持续时间的影响

3.4.3. 热激响应体积的影响

3.4.4. 脉冲式热激的影响

3.5. 本章小结

第4章用链亲和素修饰的磁性颗粒特异性分离GroEL mRNA的研究

4.1. 分离策略的确定

4.2. 用链亲和素修饰的磁性颗粒分离GroEL mRNA的效果评价

4.2.1. 大肠杆菌细胞的裂解与GroEL mRNA分子的保护

4.2.2. 分离的特异性

4.2.3. 分离纯度与得率

4.2.4. 分离的可重复性

4.3. GroEL mRNA磁性分离过程优化

4.3.1. GroEL mRNA分子的直接捕获与间接捕获的比较

4.3.2.DNA污染的消除

4.4. 本章小结

第5章GroEL mRNA作为大肠杆菌细胞活性标志物信号的放大与检测

5.1. RT-PCR对GroEL mRNA的扩增的必要性及其与微系统的兼容性

5.2. 电化学检测的优越性

5.2.1. 基于Ag/Au催化反应的电化学检测及其微系统兼容性

5.2.2. 电化学检测与凝胶电泳检测的比较

5.3. 本章小结

第6章结论与展望

6.1. 结论

6.2. 创新点

6.3. 展望

参考文献

图表索引

硕士就读期间成果

致谢