β-1，4-半乳糖基转移酶在毕赤酵母中的克隆、表达及活性测定

摘要

本文β-1，4-半乳糖基转移酶在毕赤酵母中的克隆、表达及活性测定进行了研究，文章采用降落PCR技术，以含有β-1,4-GT基因的pGEX-4T-2质粒为模板对β-1,4-GT基因进行克隆改造，测定了克隆获得的DNA片段，与已知的基因序列一致。将克隆获得基因插入到毕赤酵母表达载体pPIC9K的多克隆位点EcoR Ⅰ和Not Ⅰ之间，构建了重组分泌表达质粒pPIC9K-GT。应用电穿孔法将线性化的重组表达质粒转入宿主感受态细胞GS115，经筛选获得β-1,4-GT多拷贝整合酵母工程菌Pochia pastoris GS115。在0.5％(v/v)甲醇诱导下，工程菌Pochia pastoris GS115成功分泌了β-1,4-GT。将SDS-PAGE蛋白电泳进行密度扫描，显示β-1,4-GT占总分泌蛋白的35％。用Sephadex G-75凝胶过滤来纯化分泌蛋白，最终得率为92mg/L。将在1分钟内能转化1nmol底物所需的酶量定义为一个酶活力单位。利用苯酚红会随H+浓度改变在557nm光密度值变化的特点，测定β-1,4-GT的酶活为98.6U，酶的比活力为21.43U/mg。同时对胞外分泌和胞内蛋白的酶活进行了比较。

目录

第一篇：论文综述部分

第一部分：β-1，4-半乳糖基转移酶的研究进展

前言

1、β-1，4-半乳糖基转移酶家族的发现与克隆

2、两类β-1，4-半乳糖基转移酶的区别

3、β-1，4-半乳糖基转移酶的蛋白分子结构

4、β-1，4-半乳糖基转移酶的生物学功能

参考文献

第二部分：毕赤酵母外源基因表达系统的应用及研究进展

前言

1、 毕赤酵母表达宿主菌

2、 毕赤酵母表达载体

3、 重组表达载体与毕赤酵母的转化及整合

4、 外源蛋白在其中的表达

5、 毕赤酵母表达系统与大肠杆菌表达系统的比较

6、 毕赤酵母表达系统的应用及研究进展

参考文献

第二篇：论文实验部分β-1，4-半乳糖基转移酶在毕赤酵母中的克隆、表达及其活性的研究

前言

实验流程图：

1.实验材料和仪器

1.1菌种

1.2质粒

1.3酶及蛋白制剂

1.4各种试剂盒

1.5其他试剂

1.6常用溶液及缓冲液

1.7培养液和固体培养基

1.8各种电泳胶的制备

1.9主要仪器

2.实验方法

2.1引物的设计与合成

2.2β-1,4-GT基因克隆片段的制备

2.3改造后的β-1,4-GT基因片段的回收

2.4 pUCm-GT的构建及鉴定

2.5测序及序列分析

2.6 pPIC9K-GT表达质粒的构建及鉴定

2.7 pPIC9K-GT表达工程菌的制备

2.8 Mut+表型重组酵母的诱导表达实验

2.9β-1,4-GT的纯化

2.10β-1,4-GT的活性测定

2.11胞外分泌及胞内保留的β-1,4-GT的酶活比较

3.实验结果

3.1β-1,4-GT基因的改造和克隆

3.2阳性克隆的筛选及酶切鉴定

3.3 Fe-SOD基因的序列及分析

3.5 pPIC9K-GT质粒的构建

3.6pPIC9K-GT基因在毕赤酵母GS115中的表达

3.7β-1，4-GT的纯化

3.8β-1，4-GT的活性测定

3.9胞外分泌及胞内保留的β-1，4-GT的活性比较

4.讨论

4.1重组质粒pPIC9K-GT线性化原因

4.2巴斯德毕赤酵母的转化方法的选择

4.3表达系统的选择

4.4毕赤酵母发酵培养基的选择

4.5活性测定

5.总结

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文

附录一：(英文缩写词表)

附录二：(质粒pPIC9K图谱)

附录三：碱提取质粒方法

附录四：LiCl转化法

致谢