人MDS荷瘤小鼠模型的建立及砷剂、沙利度胺在荷瘤小鼠体内抗瘤作用与机制的研究

摘要

骨髓增生异常综合征(myelodysplasticsyndromes，MDS)是一组起源于造血干/祖细胞的恶性克隆性疾病，以骨髓病态造血、外周血细胞减少及高风险转化为急性髓细胞性白血病(acutemyelocyticleukaemia，AML)为主要特征。迄今MDS的发病机制不明，仍无标准有效的治疗方案。因此，迫切需要寻找新的有效的治疗药物。三氧化二砷(arsenictrioxide，ATO)，是目前研究的热点之一。多年来ATO用于治疗初发或复发难治性急性早幼粒细胞白血病(acutepromyelocyticleukemia，APL)疗效显著；ATO治疗APL至少通过两种机制：一种是降解融合蛋白PMLRARa，去除它对网络信号传导和诱导分化的负性抑制作用，另一种是诱导细胞凋亡。而ATO治疗MDS的疗效报道不一，其机制不明。沙利度胺(Thalidomide，THAL)曾经是治疗妊娠反应的老药，近年来由于它的免疫调节、抗炎、抗肿瘤等作用又重新用于临床，治疗多发性骨髓瘤和部分实体瘤获得较满意的效果。CC5013(为Thalidomide的类似物)治疗MDS5q-患者疗效明显，但其机制不清楚。研究疾病发病机理和筛选治疗药物的最好载体之一是动物模型，迄今国内外未见有成功建立MDS动物模型的文献报道。我们试图通过建立人MDS荷瘤小鼠模型，以探讨ATO、THAL单用及联用治疗在MDS荷瘤小鼠的体内抗瘤作用及其机制，为临床治疗MDS病人提供新的思路和理论依据。 小鼠体内，可通过下调凋亡蛋白抑制因子cIAP蛋白和Survivin的表达，去除cIAP对Caspase蛋白酶级联反应途径的抑制作用及Survivin克服G2/M校正点的作用，从而导致细胞凋亡发生。 BID是Bcl-2家族促凋亡成员，能被Cleavedcaspase-8激活，CleavedBID将凋亡信号由凋亡外通路传入内通路至线粒体，促使线粒体CytC等释放，从而激活下游Caspase途径，诱导细胞凋亡。为了探讨ATO体内是否通过BID、Caspase-8途径诱导凋亡，我们用Western-blot检测各治疗组BID、Caspase-8的表达，结果治疗组均未见到BID、Caspase-8的激活带表达，提示ATO体内诱导凋亡可能是Caspase-8、BID的非依赖途径。 近年研究发现，核因子-κB(Nuclearfacter-kappaB)具有十分重要的生物学功能，与细胞生长、分化、黏附及细胞凋亡过程中的基因转录有关。而NF-κB的抑制子IκB-α对其功能活化与失活起重要的开关作用，NF-κB未激活时其异源或同源二聚体与它的阻遏亚基形成IκB-α三聚体存在于胞浆中，IκB激酶(IκBkinase，IKK)能使IκB的丝氨酸32/36磷酸化而被降解，从而激活NF-κB。研究发现，MDS骨髓中NF-κB活性增高，NF-κB抑制剂在诱导高危MDS细胞凋亡中起重要作用，NF-κB有望成为高危MDS治疗的潜在作用靶点。进一步研究表明凋亡抑制蛋白cIAP-1、cIAP-2是NF-κB下游靶基因，NF-κB对IAPs的表达起正反馈作用，促使后者抑制Caspase活性和细胞凋亡。 为了探讨ATO单用或联合THAL体内诱导荷瘤细胞凋亡与NF-κB途径的关系，我们首先用EMSA实验分析了各组NF-κB表达活性，又用Westernblot检测IκB-α蛋白(NF-κB抑制子)和凋亡抑制蛋白cIAP的表达。结果发现，与对照组比较，治疗组NF-κB的活性和cIAP的表达均显著下调，而IκB-α蛋白表达明显上调。提示ATO体内诱导荷瘤细胞凋亡的机制涉及NF-κB信号通路。认为ATO在MDS荷瘤小鼠体内可能通过上调IκB-α活性，从而抑制NF-κB的活性表达，使NF-κB丧失其对下游靶点-凋亡抑制蛋白cIAP的正反馈作用，最终去除cIPA对Caspase的抑制作用，促使细胞凋亡发生。 AP1(激活蛋白1)是一个转录调节因子，它结合的同源序列为5TGAGTCA-3。Yang等(YangH，JBiolChem，2003)研究发现，TNF-α能激活下游靶点AP1和NF-κB，诱导腺苷甲硫氨酸转移酶(MAT2)的表达上调，促进癌细胞增殖；AP1和NF-κB的活性与癌细胞增殖有关。我们用EMSA检测发现，治疗组AP1活性比对照组明显下调，提示ATO诱导荷瘤细胞凋亡与抑制AP1活性有关。 SP-1作为一种抗凋亡因子和转录调节因子，能通过抑制NF-kappaB的转录，去除其抗凋亡活性，促进神经元细胞的凋亡。我们的研究显示，对照组MDS荷瘤小鼠SP1活性增强(EMSA)、伴有荷瘤细胞凋亡率降低；而ATO治疗后，能诱导SP1活性明显下调、伴有细胞凋亡率增高，提示ATO体内诱导MDS荷瘤细胞凋亡的另一机制可能与下调SP1的活性、抑制其抗凋亡作用有关。 小结：ATO单用及联合THAL在MDS荷瘤小鼠体内诱导细胞凋亡至少通过了两条途径：一是线粒体介导-Caspase依赖的细胞凋亡途径；二是核因子kappaB(NF-κB)信号通路，认为NF-κB和IκB-α可能成为ATO诱导凋亡、治疗MDS的重要药物靶点之一。这两条通路相对独立、又在一定水平上相互联系，提示ATO体内诱导凋亡机制复杂，是多条途径、多个水平、多个步骤和多种因子之间相互协调作用的网络效应，并非单一的途径。本实验为临床寻找有效的药物作用靶点治疗MDS提供了新的思路。

目录

摘要

前言

第一部分人骨髓增生异常综合征荷瘤小鼠模型的建立

材料与方法

结果

一.成瘤率：

二.成瘤潜伏期：

三.荷瘤小鼠一般生长情况：

四.荷瘤组织生物学特性检测：

讨论

小结

参考文献

第二部分砷剂、沙利度胺单用及联用对人MDS荷瘤小鼠体内抗瘤作用的实验研究

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

第三部分砷剂单用或联合沙利度胺体内诱导人MDS荷瘤小鼠细胞凋亡机制的研究

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

结论

综述(一)急性白血病分子-细胞遗传学研究及临床应用进展

综述(二)骨髓增生异常综合征发病机制与临床研究进展

在读期间发表文章及参加科研项目情况

致谢