反义rca水稻光合特性及其Rubisco和Rubisco活化酶的亚细胞定位

摘要

Rubisco作为催化光合碳循环和光呼吸的第一步反应的酶，在调节光合速率中发挥关键作用，该酶需要进行氨甲酰化并与Mg2+结合才具有催化活力。目前公认的看法是该酶在体内的活化需要Rubisco活化酶(RCA)的促进，RCA通过释放Rubisco活化位点上的磷酸糖抑制物，促进Rubisco的氨甲酰化。为了进一步研究RCA在调节Rubisco和光合作用中的作用，我们通过反义RNA技术获得反义rca水稻，并研究RCA含量的降低对光合作用、能量耗散、Rubisco和RCA的细胞定位的影响，结果摘要如下： 利用pGEM-Teasy、pBluescriptKS+获得了RCA基因两端可以引入与双元表达载体pCAMBIA1301多克隆位点相匹配的单酶切位点，将该片段连接到pCAMBIA1301载体，构建了RCA基因的反义植物表达载体pCAMR02。通过电激法将该载体导入根癌农杆菌EHA105菌株，以根癌农杆菌介导的方法，将反义载体pCAMR02转化粳稻品种中花11，获得了抗潮霉素的再生植株，经过GUS组织化学检测和PCR鉴定，明确目的基因已经整合到这些转基因水稻基因组中。表型测定显示，有大部分反义植株在大气CO2浓度下很难生长或不能生长，部分与野生型的长势基本相同，部分存活下来转化株生长缓慢。 研究表明，只有RCA含量低于野生型的35％的植株才能引起稳态光合速率的明显下降。因此，我们选择RCA含量为野生型15-30％的反义植株进行研究，这些反义水稻能在大气CO2浓度下生长，但相对于野生型水稻，生长比较缓慢。气体交换特性测定发现与野生型水稻相比，反义植株的净光合速率(Pn)明显下降，但气孔导度(gs)和蒸腾速率(E)不变，胞间CO2浓度(Ci)明显高于野生型水稻，这说明反义水稻Pn的下降不是由于气孔导度引起的。另外，这些转基因植株的Rubisco初始活力和最大羧化速率(Vcmax)明显下降，但Rubisco含量和总活力却显著上升。因此，RCA含量的降低影响了Rubisco氨甲酰作用是光合速率下降的主要原因，而Rubisco含量的上升可能是对RCA含量下降，导致Rubisco氨甲酰作用下降引起酶活性降低的一种补偿反应。 反义rca水稻的叶肉导度大大低于野生型水稻，但是Rubisco羧化位点的CO2浓度(Cc)却明显高于野生型水稻，表明其光合速率和Vcmax的下降不是由于叶肉导度引起的。在温室条件下，反义rca水稻的线性电子流(ETR)和最大光合电子传递速率(Jmax)大大低于野生型水稻，其ETR的光强饱和点也大大低于野生型水稻。在温室条件下，反义rca水稻并没有发生明显的光抑制现象，但PSⅡ反应中心激发能捕获效率(Fv′/Fm′)和光化学猝灭(qP)明显下降。在ETR达到光饱和后，反义rca水稻的非光化学猝灭(NPQ)和高能态猝灭(qE)都还在随光强持续上升。在饱和光强下，反义水稻的NPQ和qE与野生型水稻相差不大，但在中等光强下，NPQ和qE则大大高于野生型。由于NPQ和qE主要依赖于类囊体跨膜质子梯度(ApH)，因此分析了围绕PSⅠ的环式电子流。发现这些反义rca水稻的作用光关闭后荧光瞬时上升的幅度显著地提高，而且P700+在暗中还原速率也明显快于野生型水稻，这些都表明RCA含量的减少促进了PSⅠ的环式电子流。环式电子流的上升补充了类囊体腔的酸化程度，从而促进或维持了能量的耗散。另外，反义水稻叶片的ATP含量显著高于野生型水稻，这有利于RCA活化。 Ruisco和RCA的免疫金标记细胞定位表明，在野生型和反义rca水稻叶细胞中，Rubisco都分布于叶肉细胞叶绿体的基质中，只是反义水稻的Rubisco标记密度较高。RCA除了定位于叶绿体基质中外，在类囊体上也有一定的分布，但在反义水稻中，不仅RCA的标记密度减少，而且类囊体膜上的分布比例也大大下降，导致基质中的相对比例上升。这表明当RCA含量减少时，在类囊体膜上的RCA能够转移到基质中，优先补充基质中RCA的不足。我们推测在基质中的RCA主要行使活化Rubisco的功能，在类囊体上的RCA可能具有保护膜蛋白稳定等其他的功能。这些结果为RCA是分子伴侣提供了新的证据。

目录

文摘

英文文摘

第一章 文献综述与研究意义

第二章 Rubisco活化酶基因反义表达载体的构建与水稻的遗传转化

第三章反义rca水稻的Rubisco活化和气体交换特性

第四章 Rubisco活化酶含量减少对水稻叶肉导度和光合电子传递的影响

第五章 Rubisco活化酶含量的减少对水稻叶片细胞中Rubisco和Rubisco活化酶的免疫定位的影响

第六章全文讨论与总结

参考文献

附录

致谢