转THPO和FL膜外区基因骨髓间充质干细胞对脐血造血干/祖细胞的体外扩增研究

摘要

造血干细胞(HSCs)是指那些具有自我更新能力并能分化为所有血系细胞的干细胞。造血干细胞移植(HSCT)常被用来治疗血液系统疾病和作为血液系统恶性疾病高剂量化疗后的支持治疗。骨髓、外周血和脐带血是人类的主要造血干细胞源。由于脐带血中含有比骨髓和外周血更高比例的原始造血干细胞，目前认为脐带血是比骨髓和细胞因子动员的外周血更有前途的造血干细胞源。同时研究发现接受脐带血移植的病人的移植物抗宿主病(GVHD)的频率明显减小。单份脐带血中的造血干细胞对于重建儿童和体重较轻的成人的造血系统是足够的，但是，对于体重较大的成年人是不够的。为了解决这个问题，必须对脐带血造血干细胞进行体外扩增。本研究利用基因工程技术发展了一种独特的转双基因骨髓间充质干细胞，并利用该转基因骨髓间充质干细胞联合细胞因子对脐带血造血干细胞进行体外扩增。 骨髓间充质干细胞(MSCs)是来源于中胚层的具有很强的自我更新和多向分化能力的干细胞。本研究成功地分离纯化了骨髓间充质干细胞，并研究了骨髓间充质干细胞的体外生长特性。这些骨髓间充质干细胞在表型上呈典型的梭形纤维状，原代培养时间大约为14d。生长动力学分析表明，骨髓间充质干细胞呈典型的“S”型生长曲线。传代培养后细胞增殖能力增强，P2-P20代之间每代持续时间大约为6d；但P20-P30代之间细胞活力下降，每代持续时间大约为9d。在200d的培养期内，群体倍增时间在30-59h之间。在1-125d的培养期内，群体倍增时间缓慢维持在30-40h之间；在125-200d的培养期内，群体倍增时间急速从40h上升到59h。81.5％的骨髓间充质干细胞处于G0/G1期，呈典型的干细胞特性。流式细胞术分析表明，骨髓间充质干细胞表面抗原CD166、CD29和CD44为阳性，CD45、CD34和HLA-DR为阴性。 血小板生成素(THPO)和Flt-3配体(FL)是两个重要的早期造血刺激因子。本研究利用RT-PCR技术成功地从含有高丰度THPO和FLmRNA的胎肝细胞中克隆了THPO和FL膜外区基因。序列分析表明，THPO基因除了在蛋白信号肽序列中有一个碱基与Genebank中序列不同外，其他序列一致；FL膜外区序列与Genebank中序列完全一致。为了将THPO和FL膜外区基因导入骨髓间充质干细胞，我们利用内部核糖体进入位点序列(IRES)构建了双顺反子共表达逆转录病毒载体pLXPFIT。利用前刺激+离心沉淀+多轮转染的转染方法将逆转录病毒载体pLXPFIT导入骨髓间充质干细胞。RT-PCR和westernblotting分析表明，转基因骨髓间充质干细胞中THPO和FL膜外区mRNA和蛋白表达水平明显高于原代骨髓间充质干细胞。酶联免疫吸附实验(ELISA)分析证明在8代的转基因骨髓间充质干细胞培养期内THPO和FL膜外区蛋白能稳定有效地分泌表达。另外，转EGFP骨髓间充质干细胞能在12代的培养期内稳定表达EGFP荧光。这些结果表明，THPO和FL膜外区基因已经成功地导入骨髓间充质干细胞，并实现了稳定高效的蛋白表达。 进一步我们研究了转基因骨髓间充质干细胞是否能有效支持脐带血造血干细胞的体外扩增。第一阶段(2wk)的含血清培养结果表明，转基因骨髓间充质干细胞联合干细胞因子(SCF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素-3(IL-3)能分别扩增有核细胞总数、CD34+细胞、CFU-Cs和CFU-GEMM达910、121、62和90倍，明显高于其他对照组的扩增倍数。尽管2wk的无血清培养对有核细胞总数、CD34+细胞和CFU-Cs的扩增倍数比含血清培养有所下降，但在两种培养条件下CFU-GEMM的扩增倍数差异不显著。为了研究转基因骨髓间充质干细胞是否能支持成鹅卵石样造血干细胞(CAFC)的长期活性，我们进行了第二阶段(6wk)的扩增培养。结果表明，在0-4wk的扩增期内，尽管转基因骨髓间充质干细胞体系对有核细胞总数、CD34+细胞、CFU-Cs和CFU-GEMM的扩增明显高于骨髓间充质干细胞体系，但是两个培养体系对所有四个指标的扩增都呈相似的下降趋势。可是，在4-6wk的扩增期内，原代骨髓间充质干细胞体系不能有效地支持造血干细胞扩增，而我们建立的转基因骨髓间充质干细胞体系能有效地支持成鹅卵石样造血干细胞的体外扩增。 为了研究转基因骨髓间充质干细胞是否能有效支持脐带血中更为原始的造血干细胞的体外扩增，我们测定了体外长期培养起始细胞(LTC-ICs)和体内SCID-小鼠体内增殖的人造血干细胞(SRC)的扩增。我们首先利用有限稀释法精确测定了扩增后造血细胞中LTC-ICs的频率。结果表明，转基因骨髓间充质干细胞体系能分别在2wk和4wk的扩增期内有效扩增LTC-ICs达10和25倍，明显高于其他培养体系。SRC实验的结果表明，移植了转基因骨髓间充质干细胞体系扩增4wk后的造血细胞的NOD/SCID小鼠骨髓单个核细胞中人CD45+细胞的比例可达54-60％，间接证明SRC得到了有效的扩增。进一步的多系造血免疫分析结果表明，无论髓系的红系表面抗原(血型糖蛋白A，GlyA)、粒系的特异表面抗原(CD33)、单核系的表面抗原(CD14)、巨核系的表面抗原(CD41)和粒巨核系表面标志(CD34)，还是淋巴系的表面抗原(CD19)都呈现阳性，说明移植进小鼠的造血干细胞(SRC)已经分化为全血系造血细胞。 总之，我们成功地建立了一种独特的转THPO和FL膜外区双基因的骨髓间充质干细胞，该转基因骨髓间充质干细胞联合细胞因子能有效支持脐带血中CFU-GEMM、LTC-ICs和SRC这些更为原始的造血于细胞的体外扩增。这一转基因骨髓间充质干细胞培养体系可能对临床脐带血造血干细胞移植具有重要的意义。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：图表目录、缩略词

第一部分文献综述第一章文献综述

第二部分研究目的意义和技术路线第二章研究目的意义和技术路线

第三部分研究正文第三章骨髓间充质干细胞的分离和培养

第三部分研究正文第四章THPO和FL膜外区的基因克隆及表达载体构建

第三部分研究正文第五章骨髓间充质干细胞的转染及表达分析

第三部分研究正文第六章转基因骨髓间充质干细胞扩增脐血CD34+细胞研究

第三部分研究正文第七章扩增后造血细胞的长期培养起始细胞(LTC-ICs)研究

第三部分研究正文第八章扩增后造血细胞中的SCID小鼠体内增殖的人造血干细胞(SRC)研究

第三部分研究正文第九章结论

第三部分研究正文参考文献(Literature Cited)

第四部分创新与未来研究方向

致谢(Acknowledgements)

附录(Appendix)